電離輻射對SIK2基因表達(dá)的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：
　　從mRNA、蛋白水平和啟動子活性研究電離輻射對SIK2基因表達(dá)的影響、作用規(guī)律和相關(guān)機(jī)制，并構(gòu)建SIK2基因的真核表達(dá)載體，為深入探討SIK2的生物學(xué)功能及其在細(xì)胞放射損傷反應(yīng)中的作用提供信息和實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.2、4和10Gy60Coγ射線照射肝癌細(xì)胞HepG2后，實時定量PCR檢測照射后0、2、4、6、10、12h時間點(diǎn)的SIK2 mRNA表達(dá)的時間效應(yīng)關(guān)系；
　　2.1、2、4、6

2、、10Gy60Coγ射線照射肝癌細(xì)胞HepG2后6h收集樣品，實時定量PCR檢測SIK2 mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng)關(guān)系；
　　3.2Gy和10Gy照射后，免疫印跡檢測SIK2蛋白隨照后時間表達(dá)水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)分析照射后HepG2細(xì)胞的周期變化；
　　4. TdR雙阻斷法同步化HepG2細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測周期變化及實時定量PCR檢測相應(yīng)時間點(diǎn)的SIK2 mRNA水平的變化；
　　5.構(gòu)建SIK2啟動子重組報告質(zhì)粒，

3、分析電離輻射誘導(dǎo)后啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化；
　　6.利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建pCMV-Tag-2B-SIK2的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　結(jié)果：
　　1.利用實時定量 PCR技術(shù)對輻射誘導(dǎo) SIK2基因表達(dá)的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明?射線照射對SIK2 mRNA表達(dá)有誘導(dǎo)表達(dá)作用，但是與輻射劑量間沒有明顯的依賴關(guān)系（P>0.05）；在時間效應(yīng)方面，發(fā)現(xiàn)2Gy、4Gy和10Gy照射后10 h時間點(diǎn)，SIK2 mRNA表達(dá)

4、水平增加具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2. Western Blot結(jié)果表明，2Gy照射后SIK2蛋白隨著照后時間的延伸而表達(dá)量增加；10Gy照射后表達(dá)變化趨勢同2Gy一樣，但增強(qiáng)的幅度相對較弱；1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy照射后，SIK2蛋白表達(dá)水平隨劑量的增加而增加。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測2Gy和10Gy輻照后HepG2細(xì)胞均在10h左右出現(xiàn)了G2/M期阻滯高峰(P<0.05)，與輻照后SIK

5、2 mRNA出現(xiàn)高峰值的時間點(diǎn)吻合；利用胸腺嘧啶雙阻斷同步化HepG2細(xì)胞后，實時定量PCR方法檢測SIK2 mRNA隨細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，結(jié)果顯著變化不顯著。由此明確了電離輻射誘發(fā) SIK2 mRNA表達(dá)增加不是細(xì)胞周期的變化的伴隨結(jié)果（P>0.05）。
　　4.構(gòu)建了SIK2基因啟動子的重組質(zhì)粒，通過雙系統(tǒng)熒光報告基因活性分析，提示SIK2的啟動子包含-2000~+119區(qū)域，可能還向上游繼續(xù)延伸；另外，-2000~+119范

6、圍區(qū)間的啟動子在輻射后10h的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加(P<0.05)。
　　5.構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Tag-2B-SIK2質(zhì)粒，通過順轉(zhuǎn)的方法鑒定質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，為 SIK2后續(xù)功能和作用機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1.電離輻射對SIK2 mRNA表達(dá)有誘導(dǎo)作用，但無明顯的劑量依賴性。
　　2.60Coγ射線誘導(dǎo)SIK2蛋白的表達(dá)水平增加，部分作用機(jī)制是照射后一定時間范圍內(nèi)SIK2