阿苯達(dá)唑聯(lián)合甘草酸二銨治療廣州管圓線蟲感染小鼠體液和細(xì)胞免疫機制的研究.pdf

1、廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)隸屬于圓線蟲目、后圓線蟲科、后網(wǎng)線蟲亞科、管圓線蟲屬,由我國學(xué)者陳心陶于1933年發(fā)現(xiàn)。其在中間宿主、轉(zhuǎn)續(xù)宿主、終末宿主和自然界中循環(huán)遷徙的過程就是其發(fā)育、繁衍的過程。人攝食生的或未完全熟的中間宿主,或被污染的水和食物可致血管圓線蟲病(angiostrongliasis)。感染后蟲體遷徙途經(jīng)的乙狀結(jié)腸、肝、心、肺、腦等器官均可能受到損傷,甚至脾、腎等蟲體并未接觸的部位

2、都有可能因為免疫反應(yīng)受損?；颊吲R床表現(xiàn)多樣,主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致嗜酸粒細(xì)胞增多性腦膜炎、腦膜腦炎、腦(脊膜)脊髓炎、腦(脊)膜神經(jīng)根炎等,也可以累及其他部位和器官,如肺部、眼部、乙狀結(jié)腸等,只是發(fā)病例數(shù)極少。廣州管圓線蟲病全球散發(fā),目前已報告3000多個病例,主要在東南亞及太平洋各島嶼流行,中國大陸、美洲大陸及加勒比海各島嶼有少量報道。我國以廣西、海南、福建、臺灣為主的南方7個省份為主要流行區(qū)域。
　　 多種淡水螺作為中間

3、宿主在更多地方的養(yǎng)殖和銷售,使得廣州管圓線蟲病成為我國最具潛在危險的食源性寄生蟲病,研究認(rèn)為廣州管圓線蟲幼蟲入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)是其發(fā)育的關(guān)鍵階段,其入侵宿主造成損傷的機制與多種因素有關(guān)。除蟲體遷徙引起組織機械性損傷、蟲體占位導(dǎo)致組織擠壓損傷及顱內(nèi)高壓、蟲體分泌的代謝物質(zhì)或死亡蟲體釋放的物質(zhì)對神經(jīng)細(xì)胞的毒性等外,機體對蟲體的防御、殺傷機制大多與免疫系統(tǒng)有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道,廣州管圓線蟲感染后,嗜酸粒細(xì)胞迅速升高；多克隆B細(xì)胞激活迅速發(fā)生,產(chǎn)生大

4、量IgE、IgM、IgG、IgA；體內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞增多；外周血IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等Th2類細(xì)胞因子明顯升高,而IL-2、IFN-γ、TNF-α等Th1類細(xì)胞因子則無明顯變化,Th1/Th2細(xì)胞因子比例失衡。免疫網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜性和多重性,T淋巴細(xì)胞在一定條件下又可以相互轉(zhuǎn)化,因此僅僅歸結(jié)為Th1/Th2細(xì)胞因子失衡,或許簡化了廣州管圓線蟲病的發(fā)病機制,除了Th1、Th2淋巴細(xì)胞參與外,其它亞群T淋巴細(xì)胞也

5、很有可能參與了發(fā)病。那么與Th1、Th2產(chǎn)生于同一前體細(xì)胞,且功能上有密切關(guān)系的CD4+CD25+Treg亞群是否也參與了廣州管圓線蟲病的發(fā)病呢?它們在發(fā)病及治療過程中有何變化?這些問題目前還未見報道。
　　 T細(xì)胞重要組成部分——CD4+CD25+T輔助細(xì)胞,又稱天然調(diào)節(jié)細(xì)胞(regulatory T cells,Treg),由胸腺T細(xì)胞或外周na(i)ve T細(xì)胞發(fā)育而來,被某些特異抗原或特定因素激活后,主要通過細(xì)胞接觸機制

6、和分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等方式發(fā)揮對CD4+/CD8+T細(xì)胞的非特異性抑制效應(yīng),在炎癥反應(yīng)中避免過強的免疫應(yīng)答造成的機體組織損傷,但如果抑制過度則可能減弱機體抗感染作用,導(dǎo)致感染遷延不愈。該細(xì)胞亞群具有的免疫抑制和免疫無反應(yīng)兩大特征,在感染免疫、腫瘤免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反應(yīng)和維持機體免疫平衡等方面的作用日益受到關(guān)注,成為目前研究最為深入的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。近年來發(fā)現(xiàn)多種寄生蟲感染過程中都有Treg的參與

7、,目前尚無其在廣州管圓線蟲病發(fā)病中作用的相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　 阿苯達(dá)唑聯(lián)合地塞米松是目前我國用用最廣泛的廣州管圓線蟲病治療方法。由于對長期大量使用地塞米松可能帶來的不良反應(yīng)的擔(dān)心,多項研究提出多種替代治療方法,但未見與地塞米松療效的比較研究。甘草酸又稱甘草甜素,是甘草中的主要活性成分。其中的甾體部分與腎上腺皮質(zhì)激素結(jié)構(gòu)相似,因此具有較強的抗炎、抗過敏、解毒等糖皮質(zhì)激素樣作用,而對下丘腦、垂體、腎上腺軸無明顯影響,故無明顯糖皮質(zhì)激

8、素的不良反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)它還具有抗病毒、抗腫瘤、抑制MMP-9及免疫調(diào)節(jié)等作用。甘草酸可誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞、糾正Th1/Th2失衡,從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。甘草酸二銨是甘草酸的二銨鹽,具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更強的生物活性,據(jù)其功能推測可以使用在廣州管圓線蟲病的治療中,或許能代替糖皮質(zhì)激素的使用,以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。但其是否真能發(fā)揮作用?療效如何?發(fā)揮治療作用的機制具體有哪些?與嗜酸粒細(xì)胞、IgE、Th1/Th2平衡、

9、CD4+CD25+Treg細(xì)胞是否有關(guān)?這些問題尚不明確。
　　 本項目擬通過對不同感染時間廣州管圓線蟲病小鼠模型相關(guān)免疫指標(biāo)的檢測,了解免疫反應(yīng)在其發(fā)病機制中的作用及具體機制；通過對不同方式治療小鼠免疫指標(biāo)的檢測及比較,了解治療機制,進(jìn)一步認(rèn)識免疫發(fā)病機制在廣州管圓線蟲病發(fā)病中所占的地位。本項目選取了廣州管圓線蟲病這一我國最具威脅的食源性傳染病的發(fā)病機制進(jìn)行深入研究,并擬通過對發(fā)病機制的進(jìn)一步認(rèn)識,找出更有效的治療方法,具有實

10、際應(yīng)用價值。具體步驟如下:(1)觀察并詳細(xì)記錄廣州管圓線蟲感染小鼠模型發(fā)病不同階段的基礎(chǔ)狀況、臨床表現(xiàn)、預(yù)后及生存時間。(2)比較小鼠感染后發(fā)病不同階段外周血、腦脊液中嗜酸粒細(xì)胞比例、IgE、IgA、IgM、IgG、IL-5、eotaxin水平。(3)比較小鼠感染后發(fā)病不同階段外周血Treg亞群數(shù)量及其中Foxp3表達(dá)。從比較結(jié)果中認(rèn)識體液免疫、嗜酸粒細(xì)胞、Th2炎癥反應(yīng)、Treg細(xì)胞和組織病理變化在廣州管圓線蟲病發(fā)病中的作用。(4)分

11、別以阿苯達(dá)唑聯(lián)合地塞米松(AD)和阿苯達(dá)唑聯(lián)合甘草酸二銨(AG)治療感染小鼠,觀察以上指標(biāo),探討甘草酸二銨的治療作用和可能機制。
　　 通過實驗優(yōu)化了用以獲取廣州管圓線蟲的人工消化法,最優(yōu)實驗流程為:人工消化液中含2g胃蛋白酶,37℃消化2小時后,過濾去除組織碎屑,以PBS洗滌濾液3次,自然沉淀后收集沉渣中幼蟲。以50條廣州管圓線蟲感染期幼蟲成功建立廣州管圓線蟲病小鼠模型。初步觀察到E50模型小鼠約自13dpi開始逐漸出現(xiàn)毛發(fā)濕

12、潤、脊柱后凸、偏癱和打轉(zhuǎn)等體征,持續(xù)并到約16dpi全部死亡,確定生存時間、體征和體重作為療效觀察指標(biāo)。以外周血嗜酸粒細(xì)胞和IgE的觀察確定10和15dpi兩個觀察時間點；通過多個臟器的病理改變的觀察,確認(rèn)腦部是做顯著病理損傷的部位,出現(xiàn)腦膜炎、蛛網(wǎng)膜下腔出血、炎癥,嗜酸粒細(xì)胞廣泛浸潤,適宜用于療效觀察。實驗觀察感染和AD、AG治療小鼠生存時間、體重和外貌體征,發(fā)現(xiàn)AD治療能夠治愈部分小鼠,使其生存時間延長、體重恢復(fù)、體征緩解,但對其余

13、大多小鼠并不能改變死亡預(yù)后,只能稍延長生存時間,并不能改善體重減低和體征出現(xiàn)；AG療效優(yōu)于AD治療,能夠治愈全部小鼠,使其生存時間延長、體重恢復(fù)、完全不出現(xiàn)脊柱后凸、偏癱和打轉(zhuǎn)等嚴(yán)重體征,毛發(fā)濕潤延后出現(xiàn)但能很快恢復(fù)。觀察感染小鼠和AD、AG治療小鼠10和15dpi時體征、嗜酸粒細(xì)胞比例、IgE、IgA、IgM、IgG、IL-5、eotaxin、IFN-γ、IFN-γ/IL-5、CD4+CD25+、CD4+Foxp3+和CD4+CD25

14、+Foxp3+細(xì)胞比例、顱內(nèi)蟲數(shù)、腦部病理變化,發(fā)現(xiàn):(1)小鼠感染后外周血和腦脊液嗜酸粒細(xì)胞比例升高,AD和AG治療都能抑制外周血和腦脊液嗜酸粒細(xì)胞,但AD停藥后腦脊液嗜酸粒細(xì)胞比例反跳；(2)小鼠感染后血清和腦脊液IgE、IgA、IgM、IgG升高,AD能抑制血清和腦脊液IgE、腦脊液IgA、血清IgM和IgG,停藥后均反跳；AG治療與AD一樣可以抑制腦脊液IgG,甚至能夠更好抑制血清和腦脊液IgE和腦脊液IgA,但對腦脊液IgM無

15、影響；(3)小鼠感染后血清和腦脊液IL-5和eotaxin升高,AD治療能夠抑制血清、腦脊液中的IL-5和eotaxin,停藥無反跳,AG治療不能抑制血清IL-5和eotaxin,甚至使得水平高于感染組,但能較AD更好抑制腦脊液IL-5和eotaxin；(4)小鼠感染后血清和腦脊液IFN-γ和IFN-γ/IL-5降低,AD治療能夠恢復(fù)血清、腦脊液中的IFN-γ和IFN-γ/IL-5,停藥后仍繼續(xù)恢復(fù),AG治療能更好恢復(fù)血清、腦脊液IFN

16、-γ和IFN-γ/IL-5；(5)小鼠感染后外周血CD4+CD25+細(xì)胞比例升高、CD4+Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例無變化,AD治療與AG治療一樣能抑制這三種細(xì)胞的比例；(6)上述指標(biāo)中與體征出現(xiàn)和加重關(guān)系最為密切的是腦脊液嗜酸粒細(xì)胞比例、血清和腦脊液IgE水平、外周血CD4+CD25+細(xì)胞比例,嗜酸粒細(xì)胞、IgE、IgG、eotaxin相互間關(guān)系密切,IL-5與eotaxin關(guān)系密切,IFN-γ和IFN-γ/

17、IL-5與嗜酸粒細(xì)胞比例、IgE、IgG、IL-5和eotaxin負(fù)相關(guān),外周血CD4+CD25+細(xì)胞比例與IgE關(guān)系密切,CD4+Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例間關(guān)系密切；(7)感染小鼠腦部病理變化多樣,以腦膜水腫,嗜酸粒及其他炎癥細(xì)胞浸潤和蛛網(wǎng)膜下腔嗜酸粒細(xì)胞浸潤最為典型。AD能緩解部分小鼠的腦部病理損傷,其余則輕度改善；AG能夠更好改善全部小鼠腦部病理損傷。
　　 總結(jié)以上結(jié)果,推測廣州管圓線蟲病體液

18、與細(xì)胞免疫發(fā)病機制如下:廣州管圓線蟲感染后蟲體代謝分泌抗原及被殺死后釋放的組織抗原激活抗原提呈細(xì)胞——淋巴系樹突狀細(xì)胞DC2,兩者共同作用選擇性活化Th2細(xì)胞?；罨腡h2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫分泌免疫球蛋白的同時,分泌特異細(xì)胞因子,趨化嗜酸粒細(xì)胞進(jìn)入蟲體入侵組織。在免疫球蛋白的協(xié)助和活化作用下,嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生脫顆粒,殺傷蟲體。過強的Th2應(yīng)答和嗜酸粒細(xì)胞分泌性毒素除殺傷蟲體外,還可能造成宿主組織損傷。幼蟲在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了抑制宿主免疫反應(yīng)從

19、而保護自身延長寄生時間的能力,蟲體某些抗原激活DC2的同時,另一些進(jìn)化了的分泌性抗原或通過死蟲釋放的抗原激活了另一群樹突狀細(xì)胞DCreg。在外周血特殊細(xì)胞因子的共同作用下,DCreg激活Treg細(xì)胞,Treg細(xì)胞發(fā)揮廣譜免疫抑制作用,使Th2應(yīng)答被控制在適度的程度,免疫球蛋白的合成和細(xì)胞因子的釋放都被抑制,嗜酸粒細(xì)胞的趨化和殺傷作用就被適度抑制。另外,蟲體某些抗原在體液免疫整體被抑制的同時,能夠激活一些非特異性B細(xì)胞克隆,產(chǎn)生大量非特異

20、性IgE,以封閉嗜酸粒細(xì)胞上的IgE受體,進(jìn)一步抑制嗜酸粒細(xì)胞殺蟲作用。這些抑制作用的結(jié)果就是宿主對蟲體的殺傷作用減低,但又不是完全無應(yīng)答,這樣就使幼蟲不被過多殺死,宿主也不會由于殺傷能力太弱致蟲數(shù)過多消耗過大而死亡；同時免疫反應(yīng)對宿主機體造成的損傷減輕,這樣就不會由于針對蟲體的免疫反應(yīng)過于強烈導(dǎo)致宿主死亡。最終目的是使得宿主在帶蟲的同時能夠更長時間、更好的存活,有利于蟲體長期寄生。AD和AG都對廣州管圓線蟲病有治療作用,AG療效更好。

21、阿苯達(dá)唑殺死幼蟲,活蟲抗原誘發(fā)的DC的激活減少,待已激活的DC代謝減少后體液免疫、Th2應(yīng)答和Treg活化均減輕,但用藥后死亡蟲體卻可能釋放抗原物質(zhì)引發(fā)不同的免疫應(yīng)答,這一應(yīng)答除包括激活Th2應(yīng)答、體液免疫甚至Treg應(yīng)答外,似乎并不抑制Th1應(yīng)答。地塞米松這時發(fā)揮免疫抑制作用,除Th2應(yīng)答以外,地塞米松還可以直接抑制嗜酸粒細(xì)胞、體液免疫、Th1應(yīng)答和DC,或許還可能通過增多Treg來進(jìn)一步抑制Th2應(yīng)答,同時恢復(fù)血腦屏障功能。但這一抑

22、制作用使得免疫損傷減輕的同時,不利于殘存活蟲的殺傷,且地塞米松直接誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用,并不清除抗原,故7天療程結(jié)束后殘存活蟲分泌抗原和尚未完全清除的死蟲抗原仍能引發(fā)免疫反應(yīng),導(dǎo)致嗜酸粒細(xì)胞、免疫球蛋白和Treg反跳?？赡苡捎赥reg反跳后的抑制作用,Th2應(yīng)答并沒有反跳,但少了地塞米松的抑制,Th1進(jìn)一步回升,Th1/Th2因此回升。雖然具體機制不明,但甘草酸二銨與阿苯達(dá)唑聯(lián)合治療可能具有更好的殺蟲作用,待已活化的DC代謝清除

23、后,活蟲分泌抗原引發(fā)的嗜酸粒細(xì)胞、體液免疫、Th2和Treg應(yīng)答都將更輕微,但死蟲抗原誘發(fā)的免疫反應(yīng)卻可能更早、更強烈或時間更長。而甘草酸二銨是通過增加Th1,改善Th1/Th2平衡來抑制Th2應(yīng)答的,故作用緩慢而持久,10dpi時雖有作用但還不足以完全抑制Th2,Th1已經(jīng)逐漸恢復(fù)。停藥后在殘余抗原物質(zhì)的刺激下,Th1進(jìn)一步回升,Treg也有反跳,使Th2逐漸降低,Th1/Th2恢復(fù)。兩種治療對Treg的作用沒有差異,具體作用機制還有