用EPR技術測量蛋白質分子內選定位點之間的距離.pdf

1、生物大分子（如蛋白質）的結構與功能研究是現代生物學的重要研究領域。定點自旋標記結合電子順磁共振(Site-Directed Spin Labeling ElectronParamagnetic Resonance，SDSL-EPR)技術是目前可以在生理環(huán)境下研究蛋白質分子結構的主要方法之一。SDSL-EPR技術利用SDSL技術在生物分子內的目的位點選擇性地標記上含有未偶自旋的氮氧自由基，再通過EPR技術測量未偶自旋的波譜狀態(tài)，通過波譜解

2、析，可以獲得標記位點的運動狀態(tài)和兩個未偶自旋間的距離及其變化。其距離測量方法的特點是測距范圍寬，受其它因素影響小，對蛋白質結構和構象變化分析更加有效。SDSL-EPR可研究溶液中類似生理環(huán)境下的蛋白質，更加適合用于測量結構變化的動態(tài)過程，解決了許多生物學研究中的難點問題，例如難以獲得結晶的蛋白質結構分析、膜蛋白和大分子蛋白復合體的構象分析、溶液狀態(tài)下蛋白質的動態(tài)變化、蛋白質之間和蛋白質與膜之間的相互作用等。
　　SDSL-EPR距

3、離測量方法目前仍然存在一些問題:由于生物樣品的多樣性，實際測量中許多因素都可能引起連續(xù)波電子順磁共振(Continues Wave ElectronParamagnetic Resonance，CW-EPR)波譜增寬，包括待標記位點的不完全標記、生物分子的整體運動和自旋標記側鏈的局部運動、自旋弛豫效應、測量溫度以及波譜測量參數選擇等，這些因素都會引入距離測量誤差。然而，目前所有的CW-EPR距離計算方法均難以完全避免上述因素對距離測量準

4、確度的影響。因此，如何有效地從EPR波譜中分辨并提取出未偶自旋相互作用導致的波譜增寬，就成為CW-EPR距離測量方法需解決的核心問題。
　　本工作的目的是針對目前SDSL-EPR距離測量方法在生物分子結構與功能研究中的現狀，建立EPR測量生物大分子內位點之間距離的實驗方法和新的距離校準與刻度方法，提高CW-EPR測量距離的準確度和精度，為在溶液或生理環(huán)境下研究蛋白質的結構與功能的關系建立新的技術方法。
　　方法:(1)在傅立

5、葉去卷積距離計算(Fourier Deconvolution DistanceMeasurement，FDDM)方法基礎上，編寫波譜擬合-傅立葉去卷積計算方法(Spectrum Simulation-Fourier Deconvolution Distance Measurement,SS-FDDM)與增寬函數高斯擬合相結合的新的距離計算軟件;通過優(yōu)化波譜擬合過程，增加波譜和增寬函數的高斯擬合程序和雙自旋波譜的反向擬合程序，改善波譜擬合

6、效果;通過在距離計算環(huán)節(jié)中增加對單/雙自旋波譜以及增寬函數的校正程序，提高距離計算的精度;運用新的距離計算軟件計算距離已知的雙自旋化合物的距離，檢驗軟件的實際應用效果并對軟件加以改進。(2)在CW-EPR測距范圍內建立不同條件下（不同溶劑、濃度、溫度、功率等）測量微量溶液樣品中未偶自旋相互作用導致的波譜增寬效應的實驗方法;合成具有剛性骨架結構、分子尺寸確定、結構穩(wěn)定的系列單/雙自旋化合物作為距離刻度標尺，在不同條件下建立客觀的距離校準和

7、刻度方法。(3)運用蛋白質分子構建距離測量的生物實驗模型:選用肝臟免疫調控蛋白肝臟及淋巴結竇內皮細胞C型凝集素(the human liver andlymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin，hLSECtin)的糖基識別結構域(carbohydrate-recognition domains，CRD)為模板，在其鈣離子結合區(qū)域設計單/雙半胱氨酸(Cys)突變體，利用定點自旋

8、標記技術將單/雙未偶自旋引入模型樣品，通過pET28b-Tat原核表達載體表達模型樣品，為后期測量未偶自旋間距離的變化特性并對所建立方法進行應用和驗證奠定基礎。
　　結果:(1)綜合應用EPR波譜擬合、增寬函數的高斯擬合和雙自旋波譜反向擬合等方法，改進了原有的距離計算方法(S S-FDDM);通過比較不同條件下C60雙自旋分子的距離計算結果，證明新的計算方法對波譜的處理更靈活，擴大了波譜擬合軟件的適用范圍，特別是對低溫粉末譜的有效

9、擬合，能有效消除實驗譜的高頻噪音，并可去除人工確定增寬函數截止點的過程，在一定程度上克服人為因素的影響，對距離計算的準確性和客觀性均有提高;新的波譜擬合-距離計算軟件基本可以適用于大部分未偶自旋相互作用的EPR波譜解析和去卷積計算。(2)構建了三種雙自旋間距不同的以C60為骨架的雙自旋化合物作為距離刻度標尺。實驗表明C60雙自旋分子尺寸確定、分子穩(wěn)定、骨架結構剛性好，滿足距離刻度標尺的要求，且在結構上優(yōu)于同類實驗采用雙螺旋核酸結構或“炔

10、-苯”骨架結構的標尺。結合不同條件下的距離測量結果，優(yōu)化了微量溶液樣品中未偶自旋相互作用導致的波譜增寬效應的實驗條件，建立了不同條件下（不同溶劑、濃度、溫度、功率）的距離刻度方法和校正標準;目前的距離刻度范圍為8～14(A)，綜合各種條件獲得的距離測量精度約為0.84(A)。(3)成功構建了單/雙Cys點突變hLSECtin-CRD結構域蛋白模型，通過pET28b-Tat載體實現了六組單/雙Cys點突變蛋白模型的高效可溶性表達，并獲得了

11、初步純化的樣品，為進一步開展hLSECtin-CRD的構象變化分析提供了條件。
　　結論:本工作提出了用雙自旋化合物分子對EPR測量距離進行校正與刻度并建立相應實驗方法的設想。改進并編制了新的CW-EPR距離計算軟件;在8-14A范圍建立了穩(wěn)定的雙自旋距離刻度分子標尺及其距離刻度與校正的實驗方法;完成了單/雙Cys點突變體距離測量蛋白質實驗模型的構建。課題研究結果已基本達到了建立EPR測量生物大分子內位點之間距離方法的目的。