Omi切割Hax-1加劇腦缺血再灌注損傷的機制研究.pdf

1、目的：
　　觀察絲氨酸蛋白酶Omi在大腦缺血再灌注損傷中的作用，進一步探究其分子機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)小鼠成神經(jīng)細胞瘤（N2a）細胞，建立缺氧缺糖/復氧復糖（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）細胞模型。利用線栓堵塞ICR小鼠大腦中動脈，建立短暫性大腦中動脈缺血再灌注（transient middle cerebral artery occlusion

2、/reperfusion，tMCAO/R）動物模型。利用這兩種模型，我們用 Western blot法檢測N2a細胞與鼠腦缺血皮層組織中Omi與Hax-1蛋白水平的改變。N2a細胞敲減Omi后檢測Hax-1蛋白水平的變化，觀察OGD/R下Omi對Hax-1表達的影響。利用蛋白酶體抑制劑MG132（10μM）與自噬溶酶體抑制劑Bafilomycin A1（1μM）處理N2a細胞，分析OGD/R下Hax-1蛋白含量。利用MTT法與Weste

3、rn blot法檢測OGD/R下N2a細胞過表達Hax-1或加入Omi蛋白酶體抑制劑UCF-101（10μM）對細胞生存活力的影響，同時檢測細胞中相應Omi與Hax-1蛋白水平的變化。免疫熒光法檢測Omi與Hax-1在細胞中的定位。Tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）或Hoechst染色結合Western blot法檢測OGD/R下N2a細胞過表達Hax-1或UCF-101處理對線粒體膜電勢與細

4、胞凋亡的作用，同時檢測細胞 caspase-3活化情況。通過Western blot法檢測腹腔注射UCF-101（7.15 mg/kg）后小鼠大腦缺血皮層組織中Hax-1蛋白水平的變化與 caspase-3活化情況。最后用2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色法計算腦缺血梗死體積，觀察UCF-101在小鼠缺血再灌注損傷的作用。
　　結果：
　　Western blot檢測發(fā)現(xiàn)OG

5、D/R細胞模型與tMCAO/R動物模型中Omi蛋白表達上升，Hax-1蛋白表達下降。N2a細胞敲減Omi，OGD/R下Hax-1表達上升，表明Omi對Hax-1的表達有調(diào)控作用。N2a細胞加入蛋白酶體抑制劑MG132或自噬溶酶體抑制劑Bafilomycin A1處理后，OGD/R下Hax-1蛋白水平?jīng)]有明顯上升，表明Hax-1降解與泛素蛋白酶體系統(tǒng)或自噬溶酶體系統(tǒng)關系不大。MTT實驗發(fā)現(xiàn)N2a細胞過表達Hax-1或加入UCF-101處理

6、后，細胞抗缺氧缺糖能力增強，生存活力提高。免疫熒光實驗表明Omi與Hax-1都定位于線粒體。TMRM與Hoechst染色表明，N2a 細胞過表達Hax-1或加入UCF-101處理后OGD/R下線粒體膜電勢恢復，細胞核皺縮減少，活化型caspase-3水平降低，凋亡減少。Western blot與TTC染色發(fā)現(xiàn)UCF-101作用下，鼠腦缺血皮層Hax-1蛋白水平回升，活化型caspase-3降低，腦梗死體積減少，表明UCF-10