2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、在本文中,我們將深入探討miR-708在腦IRI中的作用及其作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制,為開發(fā)出新的缺血性腦損傷治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
  第一部分 miR-708在大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)
  目的:
  觀察大鼠MCAO模型中miR-708的表達(dá),初步探討miR-708的表達(dá)與缺血再灌注損傷的關(guān)系。
  方法:
  取25只成年SD大鼠,隨機(jī)抽取10只僅做股動(dòng)脈分離,設(shè)為對(duì)照組,其余大鼠采用經(jīng)典的線栓法制備大鼠

2、MCAO模型,缺血90min后將線栓拔出,縫合傷口,將術(shù)后存活的10只SD大鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。再灌注24小時(shí)后,麻醉2組小鼠,通過眼眶取血(每只500μl),并用PBS通過心臟灌注后取腦梗死核心區(qū)組織。一部分組織用于切片,一部分組織用于提取RNA。用于切片的組織每隔2mm切一片,將切片置于TTC染液中染色后拍照,計(jì)算梗死體積。用于提取RNA的組織,利用Trizol提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,real-time PCR檢測(cè)miR-708的表

3、達(dá)。采集的大鼠全血通過試劑盒分離提取外周血mRNA,利用real-time PCR檢測(cè)miR-708的表達(dá)水平。
  結(jié)果:
  1.TTC染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腦皮層下白質(zhì)的染色呈現(xiàn)紅色,而實(shí)驗(yàn)組大鼠腦皮層下白質(zhì)的TTC染色則呈現(xiàn)灰白色,表明皮層下梗死,說明造模成功。
  2.與對(duì)照組相比,外周血及腦組織中實(shí)驗(yàn)組miR-708的mRNA表達(dá)顯著降低,說明miR-708的表達(dá)在腦IRI中降低。
  結(jié)論:

4、>  腦IRI的大鼠外周血及腦組織中miR-708表達(dá)降低。
  第二部分 miR-708在體外細(xì)胞缺血再灌注模型中的作用
  目的:
  利用氧糖剝奪和復(fù)氧(Oxygen and glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)建立體外腦IRI模型闡明miR-708在腦IRI中的作用,包括對(duì)OGD/R細(xì)胞的增殖,凋亡,細(xì)胞周期分布,遷移,浸潤以及神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)的影響,以明確m

5、iR-708在腦IRI中的作用。
  方法:
  1.采用OGD/R處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞,構(gòu)建體外細(xì)胞IRI模型;
  2.提取對(duì)照及OGD/R組細(xì)胞的RNA,利用real-time PCR的方法檢測(cè)miR-708的表達(dá);
  3.采用AnnexinⅤ和PI雙染利用流式細(xì)胞檢測(cè)OGD/R后細(xì)胞的凋亡情況;
  4.通過轉(zhuǎn)染miR-708的模擬物及對(duì)照檢測(cè)其對(duì)OGD/R引起的細(xì)胞凋亡(Anne

6、xinⅤ)及細(xì)胞周期(流式分析)的作用;
  5.利用Transwell檢測(cè)miR-708模擬物對(duì)OGD/R細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞侵襲能力的影響;
  6.利用免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)。
  結(jié)果:
  1.我們發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞OGD/R模型中,細(xì)胞總凋亡率隨著OGD處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在OGD處理6小時(shí)后,細(xì)胞凋亡顯著增加,達(dá)到對(duì)照的近10倍左右;
  2.我們采用4/48小時(shí)(氧糖剝奪4小時(shí),復(fù)氧

7、復(fù)糖48小時(shí))的方案構(gòu)建體外腦IRI模型,發(fā)現(xiàn)在缺氧再復(fù)氧后,miR-708的表達(dá)顯著降低;
  3.在體外模型OGD/R中轉(zhuǎn)染對(duì)照或miR-708的模擬物后,real-time PCR結(jié)果顯示miR-708模擬物顯著增加OGD/R中miR-708的表達(dá)水平,miR-708模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力較對(duì)照顯著增強(qiáng)。此外,發(fā)現(xiàn)miR-708模擬物顯著降低OGD/R細(xì)胞的凋亡水平,從29.19%降到16.19%。另外,發(fā)現(xiàn)miR-708

8、模擬物顯著降低G1期細(xì)胞百分比,且顯著增加S期細(xì)胞百分比;
  4.利用Tranwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-708模擬物或?qū)φ辙D(zhuǎn)染的OGD/R細(xì)胞的遷移能力后發(fā)現(xiàn),miR-708模擬物顯著提高細(xì)胞的遷移能力,達(dá)到對(duì)照的1.5倍左右。此外,miR-708模擬物顯著增加OGD/R細(xì)胞的浸潤能力,達(dá)到對(duì)照的2倍左右;
  5.將miR-708的模擬物轉(zhuǎn)染OGD/R細(xì)胞后,細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。
 

9、 結(jié)論:
  1.OGD/R引起SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡隨缺血的時(shí)間延長(zhǎng)而增加;
  2.miR-708的表達(dá)在OGD/R后顯著降低;
  3.在OGD/R細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-708模擬物后,SH-SY5Y細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng),而細(xì)胞凋亡水平顯著下降,細(xì)胞周期的G1期百分比顯著下降,而S期細(xì)胞的百分比顯著增加;
  4.miR-708顯著增加OGD/R細(xì)胞的遷移和浸潤能力;
  5.miR-708模擬物增加O

10、GD/R細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)。
  第三部分 miR-708通過靶向JAK1保護(hù)OGD/R引起的損傷
  目的:
  明確miR-708的靶基因,并闡明miR-708及其靶基因在減輕腦IRI中的作用機(jī)制。
  方法:
  1.通過生物信息學(xué)分析確定miR-708的靶基因;
  2.利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-708對(duì)其靶基因熒光素酶活性的作用;
  3.利用real-time

11、 PCR,免疫熒光和Western blot檢測(cè)靶基因的表達(dá);
  4.轉(zhuǎn)染靶基因的siRNA,利用Hoechst檢測(cè)靶基因?qū)GD/R細(xì)胞凋亡的作用,并利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化;
  5.利用免疫熒光和real-time PCR檢測(cè)在OGD/R后干擾miR-708的靶基因JAK1表達(dá)后神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)變化。
  6.利用real-time PCR檢測(cè)腦IRI模型及對(duì)照中JAK1

12、的表達(dá),并統(tǒng)計(jì)JAK1與miR-708表達(dá)的相關(guān)性,利用Western blot檢測(cè)腦IRI模型及對(duì)照中JAK1及剪切型caspase3的蛋白表達(dá)。
  結(jié)果:
  1.通過生物信息學(xué)方法分析JAK1為miR-708的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-708顯著降低野生型JAK1的熒光素酶活性,而miR-708對(duì)突變型JAK1的熒光素酶活性則無作用;
  2.miR-708類似物顯著降低JAK1的表達(dá);
  3.在OGD/R處

13、理的SH-SY5Y細(xì)胞中,JAK1mRNA表達(dá)顯著增加,達(dá)到對(duì)照的3倍,與mRNA相同,OGD/R細(xì)胞中的JAK1的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;
  4.利用siRNA抑制JAK1的表達(dá)后,顯著降低OGD/R細(xì)胞的凋亡水平顯著降低,JAK1信號(hào)通路的下游分子STAT3的表達(dá)顯著降低,剪切型Caspase3表達(dá)顯著降低而Bc12家族的Mcl-1表達(dá)明顯增加;miR-708模擬物同樣顯著降低JAK1及其下游分子STAT3的表達(dá),并下調(diào)

14、剪切型Caspase3的表達(dá)和上調(diào)Mcl-1的表達(dá);
  3.miR-708模擬物和抑制JAK1的表達(dá)均顯著增加OGD/R細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2和NeuN的mRNA表達(dá)水平;
  4.與對(duì)照相比,大鼠腦IRI模型中JAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加,且在IRI的大鼠腦組織中Caspase3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組;相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-708與JAK1表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
  結(jié)論:
  1.JAK1為miR-

15、708的靶基因,miR-708顯著降低野生型JAK1的熒光素活性;
  2.在OGD/R細(xì)胞中,JAK1的轉(zhuǎn)錄(mRNA)和翻譯(蛋白)水平都顯著升高,在大鼠腦IRI模型中JAK1的表達(dá)也顯著增加;
  3.與對(duì)照相比,miR-708模擬物轉(zhuǎn)染的OGD/R處理的SH-SY5Y細(xì)胞中JAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低;
  4.siRNA干擾JAK1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),OGD/R細(xì)胞的凋亡水平顯著降低,凋亡相關(guān)蛋白Cle

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