斜紋夜蛾SL-1細胞色素C基因的克隆及其原核表達.pdf

1、細胞凋亡(Apoptosis)是現(xiàn)代生命科學研究的熱門領域，在哺乳動物、線蟲和果蠅中，細胞凋亡的研究非常廣泛，凋亡的分子機制也取得了較大的進展。雖然細胞凋亡的分子機制在整個生物進化過程中是高度保守，而且哺乳動物細胞凋亡途徑與昆蟲細胞凋亡途徑有許多相似之處，但也存在許多不同的地方，比如細胞凋亡的線粒體通路中，在哺乳動物的細胞凋亡中是由于細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，與細胞質中的Apaf-1結合，從而活化caspase，進而導致細胞凋亡

2、的發(fā)生。而在果蠅和線蟲的細胞凋亡中，細胞色素C的作用卻與哺乳動物的不太一致。但是鱗翅目昆蟲細胞凋亡研究顯示Cyto C的作用與哺乳動物細胞凋亡相似，即凋亡細胞過程中發(fā)生Cyto C的釋放等事件。由于Cyto C在線粒體信號通路中具有重要的作用，而且迄今有關鱗翅目昆蟲細胞凋亡過程中Cyto C釋放的檢測、定位或無細胞體系研究等均是以哺乳動物Cyto C和其抗體進行的，由于Cyto C在鱗翅目昆蟲和雙翅目昆蟲細胞凋亡中的作用存在差異，為揭示

3、和闡述Cyto C在鱗翅目昆蟲細胞凋亡過程中的作用及其分子機制，我們擬克隆和表達斜紋夜蛾(Spodoptera litura)Cyto C，利用內(nèi)源性Cyto C系統(tǒng)為研究鱗翅目昆蟲細胞細胞色素C介導線粒體信號途徑的地位與作用奠定基礎。
　　 本文克隆了鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾(Spodoptera litura)的細胞色素C基因，構建了細胞色素C蛋白的原核表達重組質粒(pET-28a-Cyto C)和真核表達重組質粒(pIZT/V5

4、-His-Cyto C)，并實現(xiàn)了細胞色素C基因的原核表達。
　　 首先利用細胞色素C在不同物種中保守性較高的特點，根據(jù)家蠶(Bombyx mori)和果蠅(Drosophila)的細胞色素C序列的高度保守區(qū)設計一對簡并引物，利用Trizol法提取斜紋夜蛾(SL-1)細胞中的總RNA，經(jīng)反轉錄和PCR擴增，得到一條長247bp的cDNA序列；然后以這條序列為基礎，設計了幾組3'-RACE和5'-RACE特異性引物，再利用SMAR

5、T RACE技術克隆了SL-1細胞的細胞色素C的3’端和5'端序列；最后通過拼接得到一個長801bp細胞色素C的cDNA序列，該cDNA包含一個327bp的開放閱讀框，編碼108個氨基酸，在3’端有一個長247bp的非編碼區(qū)(不含ployA尾)，5'端有一個長172bp的非編碼區(qū)。NCBI序列比對，顯示它與果蠅(Drosophila)和家蠶(Bombyx mori)的細胞色素C序列的同源性分別為80％和82％。
　　 得到SL-

6、1細胞的細胞色素C的cDNA全長序列后，根據(jù)其開放閱讀框設計引物，通過PCR擴增出細胞色素C的開放閱讀框，利用NdeⅠ和HindⅢ對其進行雙酶切，再將其連接到pET-28a載體上，構建了原核表達重組質粒(pET-28a-Cyto C)；同時，利用Kpn I和Xba I對PCR產(chǎn)物進行雙酶切，并將其連接到pIZT/V5-His載體，構建真核表達重組質粒(pIZT/V5-His-Cyto C)。
　　 原核表達重組質粒構建成功后，先