骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成骨細胞支持臍血造血干-祖細胞培養(yǎng)研究.pdf

1、背景與目的 本研究正是基于目前對成骨細胞與造血生態(tài)位區(qū)關(guān)系的最新認識，為了探索造血干祖細胞(HSPCs)體外培養(yǎng)的最適條件，也有別于現(xiàn)有的造血干細胞培養(yǎng)體系，提出了將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化的成骨樣細胞用于構(gòu)建體外造血干祖細胞培養(yǎng)體系的設想。從而進一步求證成骨細胞在體外造血干祖細胞培養(yǎng)體系中的支持作用，并試圖從不同的角度認識成骨細胞與造血的相互關(guān)系。 方法 第一部分實驗實驗分為4組：A、MSCs細胞層+HSCs；

2、B、成骨細胞層+HSCs；C、MSCs/成骨細胞層+HSCs；D、MSCs誘導的成骨樣細胞層+HSCs。實驗中細胞層平鋪于12孔板中，每組接種6個孔。設定接種HSCs后第l、3周為觀測點，進行相應的實驗。 第二部分實驗實驗分為6組：A、MSCs細胞層+HSCs；B、成骨細胞層+HSCs；C、MSCs/成骨細胞層+HSCs；D、MSCs誘導成骨樣細胞層+HSCs；E、(脫蛋白骨+MSCs)+HSCs；F、(脫蛋白骨+成骨細胞)+H

3、SCs；G、(脫蛋白骨+MSCs/成骨細胞)+HSCs；H、(脫蛋白骨+MSCs誘導成骨樣細胞)+HSCs。 第三部分實驗實驗分為兩組A、MSCs誘導分化的成骨樣細胞未轉(zhuǎn)染EGFP基因直接復合人源完全脫蛋白骨；B、MSCs誘導分化的成骨樣細胞轉(zhuǎn)染EGFP基因后復合人源完全脫蛋白骨。實驗中每組中各有5塊復合骨。設定細胞復合衍生骨后第12天為觀測點。制備人源脫蛋白生物衍生骨。進行骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外原代培養(yǎng)和鑒定后，將第

4、2代MSCs誘導分化為成骨樣細胞并進行鑒定。然后通過電穿孔轉(zhuǎn)染方式將EGFP基因轉(zhuǎn)染到成骨樣細胞中，當轉(zhuǎn)染的成骨樣細胞長至70～80％融合時，開始用G418(新霉素)加壓篩選。將穩(wěn)定表達EGFP基因的的成骨樣細胞以及未轉(zhuǎn)染EGFP基因的成骨樣細胞復合于人源完全脫蛋白骨后12天，利用倒置相差顯微鏡，掃描電鏡，激光共聚焦顯微鏡，采用盲法進行觀察比較。 第四部分實驗免疫磁珠分選CD34+臍血干祖細胞(HSPCs)，平均分為三組，即未轉(zhuǎn)

5、染EGFP組、陽離子聚合物轉(zhuǎn)染EGFP組和電穿孔轉(zhuǎn)染EGFP組，按照不同分組分別采用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染方式和電穿孔轉(zhuǎn)染方式將EGFP基因轉(zhuǎn)入ACD34+臍血干祖細胞，然后各組臍血CD34+細胞接種在人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)構(gòu)建的二維培養(yǎng)體系中。在無外源性細胞因子情況下進行體外培養(yǎng)7天后，進行CFU實驗和HPP-CFU實驗。并利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染EGFP的CD34+細胞集落形成，Wright-Giemsa染色了解其分化情況。

6、 結(jié)果 第一部分實驗在利用MSCs、顱骨成骨細胞，MSCs／成骨細胞(1：2)以及MSCs誘導分化的成骨樣細胞所構(gòu)建的造血干／祖細胞(HSPCs)二維培養(yǎng)體系中，未加入外源性細胞因子的情況下，成骨細胞作為飼養(yǎng)細胞的二維培養(yǎng)體系可以支持體外HSPCs培養(yǎng)，而骨髓MSCs誘導成骨樣細胞對于臍帶血造血干／祖細胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于其他各組培養(yǎng)體系，尤其對長期造血干細胞(10ng term-HSCs)體外生存有更為明顯地支持作用。

7、 第二部分實驗通過倒置相差顯微鏡，掃描電鏡以及免疫熒光標記觀察，已成功地將骨髓MSCs、顱骨成骨細胞，MSCs／成骨細胞(1：2)以及誘導的成骨樣細胞復合在人源生物衍生骨—完全脫蛋白骨上，構(gòu)建了造血干細胞三維培養(yǎng)體系。在無外源性細胞因子作用下，HSPCs培養(yǎng)2w后進行造血祖細胞集落與LTC-IC分析。比較各組CFU-C可見E、F、G、H三維培養(yǎng)顯著多于A、B、C、D二維培養(yǎng)(P<0.05)，而三維培養(yǎng)各組間沒有差異(P>0.05)

8、；比較各組HPP-CFU可見E、F、G、H三維培養(yǎng)顯著多于A、B、C、D二維培養(yǎng)(P<0.05)，而在三維培養(yǎng)各組間H組又明顯多于其他各組(P<0.05)。14天后的LTC-IC比較，三維培養(yǎng)中的H組和F組分別與其他各組差異顯著(P<0.05)，而G組，E組和二維培養(yǎng)的D組，B組間沒有顯著性差異(P>0.05)。造血干／祖細胞培養(yǎng)5w后二維培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)細胞層已逐漸凋亡，崩解，脫落，絕大部分的二維培養(yǎng)體系均破壞；而三維培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)細胞

9、層則細胞生長情況較好，支持造血干／祖細胞長期培養(yǎng)。5w后三維培養(yǎng)的各組進行造血干細胞集落分析，H組與其它三組間有顯著性差異(P<0.05)，Wright-Giemsa染色可見培養(yǎng)5w后臍血造血干祖細胞集落培養(yǎng)中有向紅系、粒系分化的細胞。 第三部分實驗本研究中EGFP基因已成功地轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成骨樣細胞內(nèi)，并得到有效穩(wěn)定的表達。而未轉(zhuǎn)染EGFP的對照組成骨樣細胞未見綠色熒光。在轉(zhuǎn)染6d以內(nèi)，細胞的增殖速度稍慢于對照

10、組，而6～12d后基本恢復正常；并且非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組同一時間點的細胞形態(tài)無明顯差別，未見明顯的細胞毒性。本研究通過倒置顯微鏡，掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡的觀察，證明了轉(zhuǎn)染EGFP基因的成骨樣細胞已經(jīng)成功地復合于人源生物衍生骨上，且生長狀態(tài)較好。本研究采用盲法觀察發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染EGFP基因的成骨樣細胞復合情況相比，轉(zhuǎn)染組沒有明顯地差異。由此可見誘導的成骨樣細胞盡管轉(zhuǎn)染了EGFP基因，但細胞復合衍生骨的能力以及增殖生長活性沒有受到明顯的損害

11、。 第四部分實驗本研究發(fā)現(xiàn)無論是陽離子聚合物轉(zhuǎn)染還是電穿孔轉(zhuǎn)染都可明顯減少造血干祖細胞集落形成的數(shù)目，且集落的大小也較未轉(zhuǎn)染組小，尤其陽離子聚合物轉(zhuǎn)染組更為明顯。同時比較兩種方式轉(zhuǎn)染EGFP基因培養(yǎng)7天后熒光集落形成，可發(fā)現(xiàn)電穿孔轉(zhuǎn)染組的集落數(shù)目明顯多于陽離子聚合物轉(zhuǎn)染組，且所形成的熒光集落更大更亮。對于熒光集落細胞的Wright-Giemsa染色可見兩種轉(zhuǎn)染方式的臍血造血干／祖細胞集落培養(yǎng)中有向紅系、粒系分化的細胞。

12、結(jié)論 第一部分實驗l、在無外源性細胞因子的參與下，由顱骨成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導的成骨樣細胞作為飼養(yǎng)細胞的二維培養(yǎng)體系確實具有支持臍血干祖細胞體外培養(yǎng)能力；2、顱骨成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導的成骨樣細胞對于長期培養(yǎng)啟動細胞(LTC-IC)體外支持作用尤為顯著；3、在所構(gòu)建的造血干細胞二維培養(yǎng)體系中，骨髓MSCs誘導成骨細胞對于造血干祖細胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于其他各組培養(yǎng)體系，尤其對于早期造血干細胞體外生存有更為明顯地

13、支持作用，說明該組培養(yǎng)體系中，骨髓誘導分化為成骨樣細胞更接近于體內(nèi)造血生態(tài)位區(qū)中成骨細胞的發(fā)生以及MSCs和成骨細胞間的比例構(gòu)成。以上結(jié)論進一步證明了成骨細胞對造血調(diào)控的關(guān)鍵性作用，同時認為成熟的成骨細胞對于造血干祖細胞的支持能力是有限的，相比之下，未成熟的成骨細胞無論在體內(nèi)還是在體外對于造血干細胞的調(diào)控，尤其是維持HSCs的靜止狀態(tài)，保持干細胞自我更新和多向分化潛能特性具有更為重要的作用。因此，本研究的結(jié)論對于維持臍血造血干細胞體外長

14、期培養(yǎng)提供了新的思路第二部分實驗 l、骨髓間充質(zhì)干細胞，成骨細胞，前二者混合細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化的成骨樣細胞復合人源生物衍生骨構(gòu)建的三維體系比相應細胞構(gòu)建的二維體系更有利于。HSPCs體外培養(yǎng)。其中較為顯著的差異是在沒有外源性細胞因子作用下，二維培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)細胞層在三周后開始逐漸凋亡，崩解，脫落。至第五周，絕大部分的二維培養(yǎng)體系均已破壞，相比之下，三維培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)細胞則沒有出現(xiàn)上述情況，細胞生長情況較好，在沒有任何外源細胞

15、因子參與下能支持造血干祖細胞體外長期培養(yǎng)； 2、以骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化的成骨樣細胞所構(gòu)建的三維體系較之其它種子細胞所構(gòu)建的三維體系對于臍血干祖細胞，尤其早期造血干細胞體外培養(yǎng)具有更為顯著地支持作用。這說明該組培養(yǎng)體系更接近于體內(nèi)造血生態(tài)位區(qū)中成骨細胞的發(fā)生和構(gòu)成以及空間主體結(jié)構(gòu)。同時，從不同的角度進一步證明了體內(nèi)骨髓問充質(zhì)干細胞定向誘導分化的成骨細胞對造血干細胞生存，增殖調(diào)控具有重要作用。 第三部分實驗1、對于骨髓間充質(zhì)干

16、細胞誘導分化的成骨樣細胞，EGFP基因電穿孔轉(zhuǎn)染盡管可造成部分細胞的損傷或死亡，但經(jīng)過篩選后穩(wěn)定表達EGFP基因的成骨樣細胞能克隆性生長，而且細胞的形態(tài)和活性已基本恢復正常。同時也說明了對于骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化的成骨樣細胞，電穿孔轉(zhuǎn)染具有轉(zhuǎn)染效率高；轉(zhuǎn)染速度快；操作簡單方便的特點。2、本研究采用盲法觀察發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染EGFP基因的成骨樣細胞復合人源生物衍生骨的情況相比，轉(zhuǎn)染組沒有明顯地差異。這說明了誘導的成骨樣細胞盡管轉(zhuǎn)染了EGFP基

17、因，但細胞復合衍生骨的能力以及增殖生長活性沒有受到明顯的損害。 第四部分實驗1、本研究根據(jù)造血干祖細胞具有自我復制，多向分化的生物學特性，通過形成熒光集落實驗來觀察、評價和比較GPF基因轉(zhuǎn)染造血干祖細胞效率和穩(wěn)定性。2、陽離子聚合物轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染一一兩種非病毒載體介導EGFP基因轉(zhuǎn)染方式對臍血造血干祖細胞體外培養(yǎng)都有影響，可造成造血干祖細胞生物學特性不同程度的損害，其中陽離子聚合物轉(zhuǎn)染對造血干祖細胞帶來的損害更大。3、相比之下