AP-1 decoy ODNs對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成及MMPs的影響.pdf

1、越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究和臨床研究證實(shí)，心室重構(gòu)是導(dǎo)致心功能減退和臨床不良預(yù)后的主要原因。左室重構(gòu)的病理改變包括兩個(gè)方面：一是心肌細(xì)胞的肥大、壞夕匕和凋亡，二是成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast cells，CFs)的增殖和心肌間質(zhì)纖維化。以往研究的焦點(diǎn)主要集中于心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)，但近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到，CFs增殖，分泌MMPs(Matrix Metalproteinases，MMPs，基質(zhì)金屬蛋白酶)在心室重

2、構(gòu)中起著十分重要的作用，因而成為心力衰竭治療的一個(gè)新靶標(biāo)[1-4]。 核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化在心臟疾病中的作用已逐漸受到人們的關(guān)注。體內(nèi)外研究表明在許多因素刺激下(如Ang Ⅱ，機(jī)械牽拉，神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等等)可引起AP-1的活化，在成纖維細(xì)胞增殖和MMPs合成中起著重要的作用。因此，本研究設(shè)想從基因水平特異性地阻斷CFs內(nèi)的AP-1的活性以減輕心肌纖維化和心室重構(gòu)的進(jìn)展。Decoy ODNs技術(shù)作為一種新的基因治療策略，可以特異

3、性地阻斷核轉(zhuǎn)錄因子的活性而抑制下游基因的表達(dá)，也極可能成為有效治療心臟疾病的新方法。為了證實(shí)研究的設(shè)想，并為AP-1 decoy ODNs治療心室重構(gòu)疾病提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)，本研究借助陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，首次應(yīng)用AP-1 decoy ODNs競(jìng)爭(zhēng)性地封閉CFs中AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)行了一下幾個(gè)方面的研究。 本研究共分3部分論述： 第一章 AP-1及MMPs在人急性心肌梗死心臟組織中的表達(dá)目的：觀察AP-

4、1、MMP-2、MMP-9及MMP-13在急性心肌梗死患者心臟組織中的表達(dá)，探討AP-1及MMPs在心肌梗死中的作用。 方法：采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)AP-1亞單位c-Jun、MMP-2、MMP-9及MMP-13在人急性心肌梗死后心臟組織及正常心臟組織中的表達(dá)。 結(jié)果：(1)正常心臟組織可組成型表達(dá)c-Jun，主要位于心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞中，心肌梗死心臟組織中，c-Jun表達(dá)上調(diào)，明顯高于正常心肌組織。(2)正常

5、心臟組織可見(jiàn)表達(dá)MMP-2、MMP-9及MMP-13，主要位于心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞中，急性心肌梗死心臟組織中，MMP-2、MMP-9及MMP-13明顯表達(dá)上調(diào)，高于正常心肌組織(3)在急性心肌梗夕匕后心臟組織中，MMP-9和MMP-13表達(dá)水平與c-Jun增高明顯成正相關(guān)。 結(jié)論：急性心肌梗死周邊區(qū)AP-1及MMPs表達(dá)均升高，這些研究提示AP-1轉(zhuǎn)錄激活及MMPs表達(dá)增加在心肌梗死心室重構(gòu)中發(fā)揮重要的作用。 第二章

6、AP-1 decoy ODNs對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成的影響第一節(jié)新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定目的：探討建立大鼠心肌成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法。 方法：無(wú)菌條件下剪取SD大鼠乳鼠心室肌，采用胰酶消化的方法消化心室，差速貼壁法分離心肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)纖維連接蛋白、波形蛋白及平滑肌激動(dòng)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：心肌成纖維細(xì)胞在體外

7、生長(zhǎng)、增殖良好，生長(zhǎng)迅速。在倒置顯微鏡下，心肌成纖維細(xì)胞呈類梭形、三角形或多邊形，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，無(wú)自發(fā)搏動(dòng)。24h細(xì)胞體積增大，呈三角形、梭型或多邊形；72h即呈融合狀態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)分離培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白、波形蛋白呈陽(yáng)性，而平滑肌激動(dòng)蛋白呈陰性。 結(jié)論：胰酶消化、反復(fù)差速貼壁法是一種合適的心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。 第二節(jié)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的AP-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的心肌

8、成纖維細(xì)胞的效率觀察　　目的：確定陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipfectamine 2000介導(dǎo)AP-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)CFs的最佳效率。 方法：人工合成AP-1 decoy ODNs，并經(jīng)全程硫代磷酸化修飾及FAM熒光素標(biāo)記。通過(guò)脂質(zhì)體AP-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的CFs細(xì)胞，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察decoy ODNs在CFs內(nèi)分布，通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察decoy ODNs的最佳轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：AP-

9、1 decoy ODNs可通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CFs細(xì)胞后，呈團(tuán)狀分布于胞漿和胞核，且較多的分布在細(xì)胞核中，而無(wú)脂質(zhì)體介導(dǎo)的AP-1 decoy ODN幾乎未見(jiàn)進(jìn)入CFs內(nèi)，但大多分散在細(xì)胞胞漿內(nèi)。通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染12h時(shí)，AP-1decoy ODNs/脂質(zhì)體(g/L)在1：1轉(zhuǎn)染效率為50.58％，在1：2時(shí)轉(zhuǎn)染效率為76.14％，在1：3時(shí)，達(dá)到最大(89.07％)，而1：4時(shí)不再增加(87.30％)；在轉(zhuǎn)染12h時(shí)，AP-1 d

10、ecoy ODNs/脂質(zhì)體(g/L)在1：1熒光強(qiáng)度為258.32，在1：2時(shí)熒光強(qiáng)度為419.89，在1：3時(shí)，達(dá)到最大572.54，而1：4時(shí)無(wú)明顯增加567.23。 結(jié)論：Lipfectamine 2000可有效地將AP-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染入CFs細(xì)胞內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)中decoy ODNs/脂質(zhì)體最佳的比為1：3。 第三節(jié) AP-1 decoy ODNs對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs增殖及膠原合成的影響　　目的：探

11、討AP-1 decoy ODNs對(duì)Ang Ⅱ引起的CFs增殖、膠原合成及基因的影響，以期為心臟纖維化基因治療提供理論依據(jù)。 方法：通過(guò)2.5％胰酶分離培養(yǎng)新生SD大鼠心臟成纖維細(xì)胞，采用四氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，羥脯氨酸比色法測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞上清膠原合成，分別觀察不同濃度的AP-1 decoy ODNs對(duì)10-7mmol/L AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖，膠原的合成的影響，利用流式細(xì)胞儀觀察Ang Ⅱ及decoy ODNs對(duì)

12、CFs周期的影響。采用RT-PCR來(lái)檢測(cè)10-7mmol/L Ang Ⅱ及AP-1 decoy ODNs對(duì)CFs Ⅰ型、Ⅲ型基因表達(dá)。 結(jié)果：AngⅡ能刺激CFs的增殖及膠原的合成量增加(與對(duì)照組相比P＜0.05)，而AP-1 decoy ODNs可劑量依賴性的抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs的增殖及膠原的合成，使細(xì)胞停滯在G0/G1期；同時(shí)AP-1 decoy ODNs可劑量依賴性抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)CFs Ⅰ型及Ⅲ型基因表達(dá)上調(diào)作用

13、，其中100nM、200nM組與AngⅡ組比，有顯著性意義，而突變的AP-1 decoy無(wú)此作用。結(jié)論：AP-1 decoy ODNs對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)CFs增殖及膠原的合成有抑制效應(yīng)，在心臟纖維化防治中發(fā)揮重要的作用。 第三部分 AP-1 decoy ODNs對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CFs增殖及MMPs合成的影響　　目的：探討AP-1 decoy ODNs對(duì)氧化應(yīng)激下CFs增殖及分泌MMPs的影響，為心室重構(gòu)的防治提供理論依據(jù)。

14、 方法：應(yīng)用EMSA檢測(cè)XXO(黃嘌呤+黃嘌嶺氧化酶)誘導(dǎo)的CFs AP-1活性變化及轉(zhuǎn)染AP-1 decoy ODNs后對(duì)其影響，采用四氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，觀察XXO及轉(zhuǎn)染AP-1 decoy ODNs后對(duì)CFs增殖影響。通過(guò)Real-time PCR和western blot檢測(cè)XXO及轉(zhuǎn)染不同濃度的AP-1 decoy ODNs對(duì)CFs表達(dá)MMP-2、MMP-9、MMP-13基因及蛋白表達(dá)影響，結(jié)果：在正常培養(yǎng)條

15、件，CFs細(xì)胞核內(nèi)有AP-1蛋白表達(dá)，但活性較低。XXO可呈劑量依賴性的方式使AP-1 DNA結(jié)合活性增加，轉(zhuǎn)染AP-1 decoy ODNs后，可以抑制這種作用。與對(duì)照組相比，OD490在XXO(0.001-0.1mU/mL)誘導(dǎo)下能夠劑量依賴性增加，而100nM、200nM decoy ODNs能夠顯著性抑制這種作用。Real-time PCR及western blot檢測(cè)CFs表達(dá)MMP-2、MMP-9、MMP-13受XXO刺激呈

16、劑量依賴性增加，AP-1 decoy ODNs能夠抑制MMP-9和MMP-13表達(dá)，而對(duì)MMP-2表達(dá)沒(méi)有影響。突變的AP-1 decoy ODNs對(duì)CFs的增殖及MMPs均沒(méi)有影響。 結(jié)論：氧化應(yīng)激能引起CFs中AP-1明顯活化，在CFs增殖和MMPs表達(dá)中發(fā)揮重要的作用，AP-1 decoy ODNs通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活化的AP-1，能夠抑制氧化應(yīng)激引起的CFs增殖及分泌MMPs，為心室重構(gòu)防治提供了新的策略。 本研究主

17、要結(jié)論： 1.人急性心肌梗死周邊區(qū)MMPs及AP-1表達(dá)水平明顯升高，AP-1轉(zhuǎn)錄激活及MMPs表達(dá)增加在心肌梗死心室重構(gòu)中發(fā)揮重要的作用。 2.胰酶消化、差速貼壁法是一種合適的心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，脂質(zhì)體可有效地將AP-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染入CFs細(xì)胞內(nèi)，其最佳比例為1：3。 3.AP-1 decoy ODNs對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)CFs增殖及膠原的合成有抑制效應(yīng)，在心臟纖維化防治中發(fā)揮重要的作用。