MicroRNA-152對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響.pdf

1、研究背景及目的:瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合的過(guò)程中，成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原過(guò)量沉積導(dǎo)致的纖維過(guò)度增生性疾病，臨床表現(xiàn)為超過(guò)原始皮損邊界、隆起于正常皮膚、常以蝶形或啞鈴形生長(zhǎng)的良性腫塊。瘢痕疙瘩患者可有局部瘙癢、疼痛等癥狀，并可因搔抓、物理摩擦等因素導(dǎo)致感染，嚴(yán)重者可繼發(fā)潰瘍甚至發(fā)生瘢痕癌;若發(fā)生瘢痕攣縮則可能導(dǎo)致功能障礙。盡管瘢痕疙瘩為一種良性疾病，不發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但因其嚴(yán)重影響美觀，且尚無(wú)單一有效的治療辦法能顯著改善其預(yù)后并減少?gòu)?fù)發(fā)，對(duì)

2、患者的生活質(zhì)量和身心健康造成巨大損害。目前對(duì)瘢痕疙瘩的發(fā)病原因存在多種解釋，已知遺傳、基因調(diào)控、細(xì)胞因子、免疫等多種因素均與瘢痕疙瘩的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)，但具體的發(fā)病原因尚不清楚。因此，進(jìn)一步探索瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療辦法成為整形外科臨床醫(yī)生及科研工作者們亟待解決的問(wèn)題。MicroRNA是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為22-25nt，在真核生物基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平具有廣泛的調(diào)控作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)microRNA參與了腫瘤、心血管

3、疾病、皮膚纖維化及某些代謝病的發(fā)生發(fā)展，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)microRNA還可以作為生物標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)而應(yīng)用于臨床。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于microRNA在瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制研究尚處于起步階段，相關(guān)研究主要集中于對(duì)瘢痕疙瘩組織或成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)的microRNA的篩選。以往的研究發(fā)現(xiàn)microRNA-152在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中存在異常表達(dá)，但其在瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚不清楚。本研究擬通過(guò)在體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維

4、細(xì)胞中轉(zhuǎn)染microRNA-152擬似物實(shí)現(xiàn)microRNA-152的過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步研究microRNA-152對(duì)于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成方面的作用，并探討可能的作用機(jī)制，以期從一定程度上解釋瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，并為瘢痕疙瘩的治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:收集手術(shù)切除的新鮮瘢痕疙瘩標(biāo)本，體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染microRNA-152 mimics（擬似物），從而實(shí)現(xiàn)microRNA-15

5、2的過(guò)表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中microRNA-152的表達(dá)情況;利用CCK法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡情況;利用羥脯氨酸比色法分析microRNA-152轉(zhuǎn)染對(duì)于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞上清液中總膠原合成的影響;利用western blot分析瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)情況;并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型前膠原及TGF-β1 mRNA的水平。

6、　　結(jié)果:在本研究中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染microRNA-152，與對(duì)照組相比實(shí)現(xiàn)了microRNA-152的過(guò)表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法RQ值(3.658±0.026)vs.(1.016±0.031)，p＜0.05; CCK法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，microRNA-152過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖率升高，48h吸光值(0.699±0.031) vs.(0.588±0.0071)，p＜0.05;72h吸光值(0.726±0.0095) vs.(0.

7、633±0.011)，p＜0.05; microRNA-152過(guò)表達(dá)組上清液中膠原蛋白含量增加，與對(duì)照組相比羥脯氨酸含量(μ g/ml)為(3.909±0.015) vs.(2.311±0.075)，p＜0.05; Westernblot檢測(cè)到microRNA-152過(guò)表達(dá)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的含量增加;RealTime PCR檢測(cè)到瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅲ型前膠原基因(COL1A、COL3A1)及TGFβ-1基

8、因mRNA水平增加，RQ值分別為(1.75±0.019) vs.(1.063±0.017)，p＜0.05;(1.356±0.074) vs.(1.045±0.061),p＜0.05;(2.12±0.03) vs.(1.08±0.033),p＜0.05。
　　結(jié)論:研究首次證實(shí)了microRNA-152可以促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及膠原蛋白合成。因此microRNA-152可能是瘢痕疙瘩發(fā)病中的重要分子之一，有望成為新的生物標(biāo)記