PeroxiredoxinI基因沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究探討反應(yīng)性氧物質(zhì)（Reactive Oxygen Species, ROS）是否參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）誘導(dǎo)的c-Jun N末端激酶（C-jun N-teminal kinase, JNK）通路的激活，刺激肺成纖維細(xì)胞（Pulmonary Fibroblasts，PF）增殖和膠原合成，從而促進(jìn)矽肺纖維化；及利用新型過(guò)氧化物酶 Peroxiredoxin I（Prx-1）對(duì) ROS的清除作用，觀察 Prx-1是否可通過(guò)

2、消除ROS來(lái)抑制 TGF-β1的這種促纖維化作用，為Prx-1成為防治矽肺的新靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5），常規(guī)培養(yǎng)，同步化后，給與細(xì)胞 TGF-β1(5μg/L)刺激，分別于刺激后0min、30min、60min、3h、24h、48h提取細(xì)胞總蛋白，用 western blot檢測(cè) TGF-β1對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞 Prx-1蛋白表達(dá)的影響。隨后，人胚肺成纖維細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)、同步化，隨機(jī)分為四

3、組：正常對(duì)照組、TGF-β1組、陰性 siRNA組和Prx-1 siRNA組，其中正常對(duì)照組中加入含0.4％血清的MEM，而TGF-β1組、陰性siRNA組和Prx-1 siRNA組的細(xì)胞則給予5μg/L TGF-β1培養(yǎng)，且陰性siRNA組和Prx-1 siRNA組的細(xì)胞預(yù)先利用lipofectamine2000分別成功轉(zhuǎn)染陰性干擾 siRNA序列和Prx-1 siRNA片段。利用激光共聚焦顯微鏡觀察 siRNA片段是否成功進(jìn)入人胚肺

4、成纖維細(xì)胞，并用 Real time PCR檢測(cè)各組siRNA片段轉(zhuǎn)染后Prx-1 mRNA的表達(dá)情況，以檢測(cè)基因封閉情況。各組細(xì)胞經(jīng)或未經(jīng) TGF-β1刺激不同時(shí)間后，利用 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況；Western blot法檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原、Prx-1、JNK及磷酸化（Phospho-JNK，p-JNK）蛋白的表達(dá)情況；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞中 DNA氧化損傷的特異性產(chǎn)物8-OHdG表達(dá)情況。
　　

5、結(jié)果：1.TGF-β1刺激人胚肺成纖維細(xì)胞Prx-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，在刺激30min時(shí)Prx-1蛋白的表達(dá)即有所增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)也越發(fā)明顯，在刺激3h時(shí)達(dá)高峰，隨后下降但仍高于對(duì)照組。2.陰性siRNA組和Prx-1 siRNA組的細(xì)胞經(jīng)羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的陰性干擾 siRNA和Prx-1 siRNA轉(zhuǎn)染16h后，細(xì)胞內(nèi)均可有綠色熒光表達(dá)，散在分布于細(xì)胞漿，說(shuō)明 siRNA被成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，其中以siRNA:脂質(zhì)體=5:5

6、轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染入胞達(dá)到80%左右；另外Real time PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組比較，三組 Prx-1 siRNA：Prx-1 siRNA(209)、Prx-1 siRNA(289)和Prx-1 siRNA(453)，均可成功降低Prx-1 mRNA的表達(dá)，而陰性siRNA則無(wú)此作用，Prx-1 siRNA(209)、Prx-1 siRNA(289)和Prx-1 siRNA(453)對(duì) Prx-1 mRNA的抑制效率分別為86%

7、、74%和95%，根據(jù)抑制效率最終選取Prx-1 siRNA(453)用于本實(shí)驗(yàn)。3.Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1刺激了人胚肺成纖維細(xì)胞 Prx-1蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，但與 TGF-β1組比較，陰性轉(zhuǎn)染組的Prx-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化而 Prx-1 siRNA組卻無(wú)明顯條帶出現(xiàn)，說(shuō)明 Prx-1 siRNA可使TGF-β1激活的Prx-1基因被沉默。4.與對(duì)照組比較，TGF-β1刺激了人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖和

8、Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的增強(qiáng)，但與 TGF-β1組比較，陰性轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)無(wú)明顯變化而Prx-1 siRNA組的變化卻進(jìn)一步明顯，說(shuō)明Prx-1對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原增加具有促進(jìn)作用。5.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激了人胚肺成纖維細(xì)胞8-OHdG水平的表達(dá)，但與 TGF-β1組比較，陰性 siRNA組的8-OHdG水平無(wú)明顯變化，而Prx-1 siRNA組則進(jìn)一

9、步明顯增加，說(shuō)明Prx-1基因沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞 ROS的生成具有促進(jìn)作用。6.各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總 JNK的表達(dá)無(wú)明顯差別；與對(duì)照組比較，TGF-β1刺激了人胚肺成纖維細(xì)胞 p-JNK水平的增加，但與TGF-β1組比較，陰性siRNA組的p-JNK水平無(wú)明顯變化而Prx-1 siRNA組的則進(jìn)一步明顯升高，說(shuō)明 Prx-1基因沉默對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞JNK磷酸化具有促進(jìn)作用。
　　結(jié)論： TGF