光刺激對新生小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的影響及基質(zhì)糖蛋白Lumican異位表達的意義.pdf

1、小鼠出生時瞼裂是閉合的，這為其相對幼稚的視網(wǎng)膜出生后的繼續(xù)發(fā)育成熟提供了生理性的黑暗環(huán)境。我們通過人工開啟單側眼瞼的方法，利用C57BL/6J(黑色近交系)小鼠成功建立了過早接受形覺刺激的動物模型，為研究過早光照對視網(wǎng)膜發(fā)育的影響提供了較理想的動物模型。前期工作表明，過早光刺激可引發(fā)小鼠可逆性的非軸性近視，并伴隨視網(wǎng)膜組織中Lumican基因轉(zhuǎn)錄活性的顯著性激活。本研究在CD1(白色遠交系)小鼠中重建并優(yōu)化了這一模型，詳細量化過早光照引

2、發(fā)的視網(wǎng)膜結構的發(fā)育異常，描述了Lumican異位表達的時間空間分布情況以及相應區(qū)域細胞生長與EMT狀態(tài)的變化。實驗從細胞與分子水平為探討提前光照影響視網(wǎng)膜發(fā)育的病理機制、解析過早光刺激與MOP發(fā)生的關聯(lián)提供了佐證。
　　 課題主要的研究方法和內(nèi)容如下：
　　 (1)優(yōu)化過早光刺激小鼠模型，選擇CD1新生小鼠替代原有的C57BL/6J作為實驗動物，一方面提高了新生小鼠出身率與健康存活比率，更為重要的是，為基于CD1遺傳背

3、景的Lumican基因敲除小鼠的引進和深入的機理研究提供可能，實驗要求嚴格杜絕對照眼球的意外感光。我們選擇P4作為開瞼時間，鈍性開啟右側眼瞼(記為實驗眼，R)，以左側眼球為自身對照(L)。采集P6、P9、P12時間點的眼球制作冰凍切片或于對應時間點抽提視網(wǎng)膜組織總蛋白、總RNA，觀察、量化不同時間點新生小鼠視網(wǎng)膜各個核層的細胞增殖與凋亡水平，分析提前光照對視網(wǎng)膜發(fā)育影響的時間空間特性。
　　 (2)觀察上述三個時間點視網(wǎng)膜中Lu

4、mican在mRNA與蛋白水平上的異位表達和分布情況；比較在該糖蛋白異常積蓄的時期，相關視網(wǎng)膜細胞增殖、凋亡和EMT的變化，為全面而深入分析該基因的蛋白產(chǎn)物影響神經(jīng)發(fā)育的潛在機制提供第一手實驗數(shù)據(jù)。
　　 主要結果與結論如下：
　　 (1)過早光刺激對視網(wǎng)膜細胞生長狀態(tài)的影響H-E染色顯示，光刺激對內(nèi)、外網(wǎng)層及視桿視錐的發(fā)育進程并不產(chǎn)生顯著性影響，卻能明顯的改變視網(wǎng)膜細胞的數(shù)量：P6-P9時期可促進內(nèi)、外核層與節(jié)細胞數(shù)量

5、的維持，P10-P12則轉(zhuǎn)而加劇細胞數(shù)量的減少。據(jù)此，我們將光刺激影響視網(wǎng)膜發(fā)育的時相分作早期的生長促進期(P6-P9)與晚期的生長抑制期(P10-P12)。
　　 (2)過早光刺激對視網(wǎng)膜細胞增殖水平的抑制以PCNA為細胞增殖指標，量化視網(wǎng)膜細胞的增殖狀態(tài)。感光細胞增殖活力受過早光刺激的抑制最為敏感，在P9時，ONL中零散分布于邊緣區(qū)域的PCNA核內(nèi)熒光信號完全消失，但該異常刺激卻并不能改變生長促進期(P6-P9)視網(wǎng)膜細胞的

6、總體增殖狀態(tài)。進入生長抑制期(P10-P12)之后，光刺激對細胞增殖水平的抑制效應進一步擴展到INL中間神經(jīng)元，節(jié)細胞在P12時生理性的PCNA再度上揚現(xiàn)象在實驗眼視網(wǎng)膜中被徹底抑制，視網(wǎng)膜細胞總體增殖水平呈顯著性的低下，僅極少數(shù)細胞核內(nèi)呈現(xiàn)出微弱的PCNA陽性信號。
　　 (3)過早光刺激對視網(wǎng)膜細胞凋亡水平的影響TUNEL染色分析視網(wǎng)膜細胞的凋亡狀態(tài)。生理狀態(tài)下，內(nèi)外核層細胞凋亡峰值形成時間不同：ONL細胞凋亡高峰出現(xiàn)在P1

7、2(自然睜眼前)，而INL則發(fā)生在P6前后。光照可全程抑制感光細胞的凋亡；對視網(wǎng)膜INL細胞凋亡的影響相對復雜：于生長促進期(P6-P9)抑制中間神經(jīng)元凋亡，于生長抑制期(P10-P12)則明顯延滯INL細胞凋亡水平的迅速下滑。
　　 綜上所述，光刺激在生長促進期(P6-P9)，主要通過抑制神經(jīng)視網(wǎng)膜(INL+ONL)細胞早期(P6時)凋亡峰的形成、導致大量的細胞存活，從而引起這一時期細胞數(shù)量的增多。P12時，盡管光照對感光細胞

8、與中間神經(jīng)元的凋亡施加了截然相反的影響，但在此時刻，實驗眼INL細胞的增殖活力卻極度減弱，加之節(jié)細胞的PCNA峰未能出現(xiàn)，故生長抑制期(P10-P12)期間，光刺激主要通過對細胞增殖的全面抑制效應來實現(xiàn)細胞數(shù)量的回落。
　　 (4)過早光刺激誘導視網(wǎng)膜中Lumican的表達Lumican主要由間充質(zhì)來源的細胞(如成纖維細胞、角膜細胞)合成，在視網(wǎng)膜、腦等外胚層起源的神經(jīng)器官組織中表達低下。光照引發(fā)視網(wǎng)膜中Lumican轉(zhuǎn)錄水平的

9、激活始發(fā)自P9，于P12達高峰，睜眼后迅速回落，至P21重新恢復沉寂。P9時，極其微量的Lumican蛋白產(chǎn)物可在視網(wǎng)膜組織總蛋白提取液中檢出，以后其含量急劇增多，P12時可見65kDa的寬幅蛋白條帶--視網(wǎng)膜中表達的Lumican是糖蛋白而非KSPG。P12時，Lumican糖蛋白主要分布在外網(wǎng)層以內(nèi)的神經(jīng)組織中，這包括：內(nèi)外網(wǎng)層、INL與GCL，主要影響中間神經(jīng)元與節(jié)細胞的生長、轉(zhuǎn)化行為。
　　 (5)Lumican異位表達

10、與相關細胞增殖水平的抑制以PCNA為細胞增殖指標，對P9和P12時的INI與GCL的細胞增殖狀態(tài)進行了進一步的量化。隨著Lumican在神經(jīng)視網(wǎng)膜INL與GCL中的蓄積，相應區(qū)域新生細胞數(shù)量銳減明顯，這一方面體現(xiàn)在P12時(Lumican異常蓄積高峰時刻)INL細胞PCNA核內(nèi)信號顯著性減少，一方面表現(xiàn)為GCL中PCNA上揚現(xiàn)象的完全消失。
　　 (6)Lumican異位表達與相關細胞凋亡水平的維持為了準確評價視網(wǎng)膜INL與GC

11、L細胞的凋亡狀態(tài)，我們選擇了Caspase-939kDa活性肽段--p39作為細胞凋亡量化指標。免疫熒光檢測證實，Caspase-9標記的細胞分布在視網(wǎng)膜(INL+GCL)核層中，而ONL中未見熒光信號；Western-blot確證該分子在這兩個核層中的存在形式主要是p39活性肽段，未見全長(49kDa)條帶出現(xiàn)，說明此抗體可以特異性標記INL與GCL中的凋亡細胞。隨著Lumican在視網(wǎng)膜中的聚集，P12時相對于對照組細胞凋亡水平的進

12、行性銳減，實驗眼視網(wǎng)膜Caspase-9 p39依舊維持在相對較高的水平，說明光刺激可于生長抑制期(P10-P12)引發(fā)這兩個核層細胞較為明顯的凋亡。
　　 綜合上述結果我們發(fā)現(xiàn)，隨著Lumican糖蛋白在神經(jīng)視網(wǎng)膜內(nèi)側區(qū)域的積蓄，相應分布區(qū)域的視網(wǎng)膜細胞表現(xiàn)出增殖活性的銳減與凋亡水平的相對維持，其綜合效應將導致(INL+GCL)細胞生長活性的減低、細胞數(shù)量的減少。這一發(fā)現(xiàn)揭示了，Lumican可能參與了光刺激對生長抑制期間(P

13、10-P12)相關核層細胞生長的調(diào)節(jié)。參考Lumican對間充質(zhì)來源細胞(如角膜細胞)具有抑增殖促凋亡的調(diào)控作用，我們據(jù)此推測，該分子對來源于神經(jīng)上皮的視網(wǎng)膜細胞也有相似的作用。正是由于光刺激引發(fā)Lumican轉(zhuǎn)錄水平的激活以及其糖蛋白產(chǎn)物在P9-P12的迅速蓄積，導致相同的刺激對不同時期的視網(wǎng)膜(尤其是INL與GCL)發(fā)育產(chǎn)生截然相反的影響--由前期的促進生長轉(zhuǎn)入后期持續(xù)的抑制。
　　 (7)Lumican異位表達與EMT值得

14、我們注意的是，光照并非立即誘發(fā)Lumican在視網(wǎng)膜中的異常表達。而上皮細胞盡管在特殊應激誘發(fā)(如損傷)下，可以重新開啟Lumican的合成潛力，但通常需經(jīng)歷EMT，且Lumican異位表達后還可以進一步維持這種異常轉(zhuǎn)化狀態(tài)。以α-SMA作為EMT量化指標、分析P6、P9、P12時間點視網(wǎng)膜EMT狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)光刺激可引發(fā)P6時α-SMA在視網(wǎng)膜中的廣泛提升以及P9時(INL+GCL)中α-SMA的富集效應，提示Lumican的表達繼發(fā)于光