Liver X receptorβ對小鼠視網膜發(fā)育和視覺功能的影響及機制研究.pdf

1、肝臟X受體（Liver X receptors，LXRs）是在哺乳動物體內廣泛分布的核受體家族成員，主要分為兩種亞型:LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)，前者主要分布于肝臟、小腸、胰腺等脂類代謝相關器官，后者則主要分布于中樞神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。LXRs在調節(jié)膽固醇代謝和炎癥反應中發(fā)揮重要作用，參與中樞神經系統(tǒng)板層結構發(fā)育以及阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）和帕金森?。≒arkinson's dis

2、ease，PD）等神經退行性疾病的病理生理過程。作為中樞神經系統(tǒng)的延續(xù)，視網膜同樣也高表達LXRβ，但該受體在視網膜發(fā)育和視功能中所起的作用尚不清楚。
　　既往研究發(fā)現，LXRβ敲除可以通過影響放射狀膠質細胞(Radial glial cells，RGCs)的長纖維形成而阻礙大腦皮層新生神經元的“內向外”(inside out)的放射狀遷移，導致大腦皮質板層發(fā)育障礙。Müller細胞被認為是位于視網膜中的特殊放射狀膠質細胞，在視網

3、膜的發(fā)育中起著十分重要的功能。研究表明，在視網膜發(fā)育過程中特異性損傷Müller細胞可導致視網膜感光細胞異位分布。離體實驗也證實，與Müller細胞共培養(yǎng)的視網膜細胞球可以恢復正常的板層結構，并形成排列規(guī)則的感光細胞層，而無Müller細胞共培養(yǎng)的感光細胞球則形成大量的“玫瑰花結”樣結構，提示Müller細胞在視網膜板層結構建立中同樣也起著十分重要的作用，可能發(fā)揮類似于中樞神經系統(tǒng)板層構筑中的RGCs作為支架引導新生神經元的遷移的作用。

4、
　　成年視網膜中Müller細胞對維持內層視網膜穩(wěn)態(tài)十分重要，主要參與了神經視網膜中神經遞質包括興奮性神經遞質谷氨酸、抑制性神經遞質γ-氨基丁酸等的清除和代謝。Müller細胞還參與了內層視網膜的水鹽代謝、視網膜血流和視網膜糖代謝的調節(jié)。其中，在調節(jié)視網膜中谷氨酸穩(wěn)態(tài)時，特異性表達于Müller細胞內的谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase， GS）在“谷氨酸-谷氨酰胺”循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。GS表達量及活性將直

5、接影響到Müller細胞清除內核層（inner nuclear layer，INL）中谷氨酸的速率，GS表達量的下調將引起細胞外谷氨酸含量增加，導致興奮性神經毒性作用。既往研究發(fā)現，GS的下調與視網膜電圖（electroretinogram，ERG）的功能變化呈正相關。在視網膜變性時，Müller細胞往往過度活化，表現為細胞形態(tài)、數量以及表達標志物的改變，此時Müller細胞對視網膜的調節(jié)作用受到影響。在一定條件下，M訌ller細胞又可

6、作為潛在的內源性視網膜干細胞，可分化產生視網膜中的神經元和膠質細胞。這一特點與位于大腦以及小腦中的RGCs一致。LXRβ對成年小鼠視網膜中的Müller細胞和視覺功能有何影響，目前尚無文獻報道。
　　LXRs具有調節(jié)中樞神經系統(tǒng)炎癥反應的作用，該調節(jié)作用與其抑制小膠質細胞以及星形膠質細胞的激活密切相關。研究發(fā)現，在LXRβ-/-小鼠的黑質部位多巴胺神經元丟失明顯多于野生小鼠，而活化的小膠質細胞和星形膠質細胞在LXRβ-/-小鼠黑質

7、中明顯增加。在AD模型中，LXRs激動劑可以抑制星形膠質細胞細胞的活化，減緩AD的進展。因此，LXRs可以通過抑制神經退行性疾病中的膠質活化，減少神經元丟失。視網膜變性時也存在膠質細胞的增生，增殖性玻璃體視網膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)以及增殖性的糖尿病性視網膜病變(proliferative diabeticretinopathy，PDR)時，Müller細胞即發(fā)生增殖及纖維化，于玻璃

8、體下腔中形成“膠質封閉”，影響視網膜修復。LXRs的激活是否可以減輕病理狀態(tài)下視網膜中炎癥反應和膠質增生目前還不清楚。在酒精致視網膜損傷的動物模型中常常可觀察到增強的膠質細胞活化，以及神經節(jié)細胞、雙極細胞、水平細胞等細胞數量和細胞形態(tài)的改變。因此，我們采用此種動物模型來研究LXRs對損傷狀態(tài)下視網膜的影響及可能機制。
　　因此，本研究提出如下假設:在發(fā)育階段和成年階段，LXRβ通過影響視網膜中Müller細胞功能而影響小鼠視網膜結

9、構及功能。激活LXRs可減輕酒精損傷新生小鼠視網膜的膠質細胞激活和神經元丟失。
　　本文的主要研究結果如下:
　　1.LXRβ對新生小鼠視網膜板層構筑的影響
　　采用HE染色、BrdU標記，免疫組化等技術，觀察LXRβ-/-小鼠和同齡的野生型小鼠視網膜結構改變。結果顯示:出生后7天，LXRβ-/-小鼠的視網膜內核層(INL)較同齡野生小鼠INL顯著增厚(p＜0.01)。BrdU陽性細胞分析結果顯示，LXRβ敲除后并不影

10、響視網膜神經元的增殖能力。LXRβ-/-小鼠視網膜INL中BLBP陽性細胞較同齡的野生小鼠顯著增多，而ONL中BLBP陽性細胞減少。
　　2.成年LXRβ-/-小鼠和同齡野生小鼠視網膜結構及視功能研究
　　通過檢測3月齡、7月齡、10月齡雄性LXRβ-/-和同齡野生小鼠的暗適應ERG，發(fā)現LXRβ-/-小鼠ERG-a波和ERG-b波幅值均較同齡野生小鼠幅值顯著降低(p＜0.01)，而a、b波的潛伏期無明顯差異(p＞0.05)

11、。免疫組化及Western-blot檢測發(fā)現:LXRβ-/-小鼠Müller細胞終足部位GS的表達較野生小鼠明顯減弱(p＜0.05)，全視網膜GS表達也較野生小鼠顯著減少(p＜0.01)。LXRβ-/-小鼠PKC-α陽性雙極細胞和PKC-α蛋白水平明顯降低(p＜0.05)。而感光細胞標記Rhodopsin免疫組化及WB結果均未發(fā)現LXRβ-/-和同齡野生小鼠之間有明顯差異(p＞0.05)。
　　3.LXRs激動劑對酒精視網膜損傷小

12、鼠模型的保護作用研究
　　為進一步證實LXRs在視網膜中的作用，采用酒精暴露致視網膜損傷的新生小鼠模型，通過HE染色和免疫組織化學法進行檢測發(fā)現:出生后6天(P6)時酒精可導致視網膜節(jié)細胞層中細胞數量減少(p＜0.01)。酒精暴露新生小鼠視網膜GCL中NeuN陽性細胞數較對照組明顯減少(p＜0.01)，酒精暴露組與T0預處理組相比，NeuN陽性細胞也明顯減少(p＜0.05)。酒精暴露組GFAP表達較對照組明顯增加(p＜0.01)，

13、酒精暴露組與T0預處理組相比，GFAP表達也明顯減少(p＜0.05)。出生后10天(P10)時，視網膜切片HE染色、NeuN和GFAP結果趨勢與P6時相同，即酒精處組GCL中細胞密度以及NeuN陽性細胞較對照組和T0預處理組明顯減少。P10發(fā)現酒精暴露小鼠GS表達量和PKC-α陽性細胞數均較對照組下降，而提前給予激動劑可以減輕酒精的這一作用。
　　結論:
　　1.LXRβ敲除導致新生小鼠(P7)視網膜中Müller成熟延遲，