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文檔簡介
1、研究目的:
本研究旨在對氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變組織差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行初步的研究,為進(jìn)一步研究miRNAs對視網(wǎng)膜新生血管的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
研究方法:
本研究共分四個部分
第一部分:OIR模型制備。實(shí)驗(yàn)組采用C57BL/6J新生幼鼠,生后第7天飼養(yǎng)在75±2%氧濃度環(huán)境中5天,返回正常空氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。對照組新生幼鼠在正??諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組與對照組各隨機(jī)選取24個視網(wǎng)膜組織進(jìn)行下一
2、步實(shí)驗(yàn)。
第二部分:OIR組織差異表達(dá)miRNAs的篩選。實(shí)驗(yàn)組與對照組隨機(jī)各選10個視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行混樣,提取樣本的總 RNA,采用 LC Sciences公司的uParaflo微流體miRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。根據(jù)預(yù)設(shè)條件,篩選出miRNAs作為研究對象進(jìn)行第三部分研究。
第三部分:OIR組織差異表達(dá) miRNAs的初步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)組與對照組隨機(jī)各選20個視網(wǎng)膜標(biāo)本,采用TaqMan qRT-PCR的方法對篩選出的
3、兩種候選miRNAs進(jìn)行定量研究和驗(yàn)證,比較在兩組間各miRNAs表達(dá)水平的差異是否與芯片結(jié)果一致。
第四部分:對篩選出差異表達(dá)的miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
第一部分:實(shí)驗(yàn)組與對照組通過眼球切片觀察玻璃體腔突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目,以及高分子量熒光素灌注法觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài),證實(shí)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型的成功建立。
第二部分:
4、 1、兩組視網(wǎng)膜樣本均可提取出合格的RNA
分別從實(shí)驗(yàn)組及對照組視網(wǎng)膜中提取總RNA,采用分光光度法檢測OD260/280,比值均符合要求。
2、總RNA與miRNA芯片雜交
用實(shí)驗(yàn)組及對照組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交,得到2張成像均勻、清晰的雜交圖像,可證實(shí)總RNA中含有miRNAs。
3、miRNAs在實(shí)驗(yàn)組及對照組中表達(dá)存在差異
采用GenePix pro V6.0軟件,
5、對探針點(diǎn)的初始熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析,然后對初始強(qiáng)度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,篩選出兩組間差異表達(dá)的miRNAs。以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界,共有31種差異表達(dá)的miRNAs,其中21種在實(shí)驗(yàn)組相對于對照組上調(diào),10種下調(diào)。
4、篩選出兩種候選miRNAs
以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界,選擇P值<0.001以及信號值大于500,最后篩選出兩種miRNA進(jìn)行第三部分實(shí)驗(yàn)。
第三部分:
1、各視網(wǎng)膜標(biāo)本中均可提取
6、出合格的RNA兩組視網(wǎng)膜標(biāo)本提取總RNA,OD260/280的比值均符合要求。
2、候選miRNAs的初步驗(yàn)證與篩選以U6 SnRNA為內(nèi)參,對各miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),第二部分實(shí)驗(yàn)中篩選出的miRNA-130a-3p、miRNA-5107-5p在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)存在顯著性差異,與芯片結(jié)果一致。
第四部分:對miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析,
7、發(fā)現(xiàn)miR-5107-5p靶基因顯著富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,甲狀腺癌通路。miR-130a-3p靶基因顯著富集于甘油脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號通路、甘油磷脂代謝等通路中。
結(jié)論:
1、通過氧誘導(dǎo)方法,可以成功建立OIR模型。
2、芯片檢測發(fā)現(xiàn),某些 miRNAs的組織表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組及對照組之間存在顯著性差異,本實(shí)驗(yàn)篩選出67種差異表達(dá)的miRNA,其中35種在實(shí)驗(yàn)組相對于對
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