氧誘導(dǎo)新生小鼠視網(wǎng)膜病變miRNA表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變組織差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行初步的研究，為進(jìn)一步研究miRNAs對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　本研究共分四個(gè)部分
　　第一部分：OIR模型制備。實(shí)驗(yàn)組采用C57BL/6J新生幼鼠，生后第7天飼養(yǎng)在75±2％氧濃度環(huán)境中5天，返回正常空氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。對(duì)照組新生幼鼠在正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各隨機(jī)選取24個(gè)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行下一

2、步實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分：OIR組織差異表達(dá)miRNAs的篩選。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)各選10個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行混樣，提取樣本的總 RNA，采用 LC Sciences公司的uParaflo微流體miRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。根據(jù)預(yù)設(shè)條件，篩選出miRNAs作為研究對(duì)象進(jìn)行第三部分研究。
　　第三部分：OIR組織差異表達(dá) miRNAs的初步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)各選20個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本，采用TaqMan qRT-PCR的方法對(duì)篩選出的

3、兩種候選miRNAs進(jìn)行定量研究和驗(yàn)證，比較在兩組間各miRNAs表達(dá)水平的差異是否與芯片結(jié)果一致。
　　第四部分：對(duì)篩選出差異表達(dá)的miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　第一部分：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組通過眼球切片觀察玻璃體腔突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目，以及高分子量熒光素灌注法觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，證實(shí)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型的成功建立。
　　第二部分：
　

4、　1、兩組視網(wǎng)膜樣本均可提取出合格的RNA
　　分別從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組視網(wǎng)膜中提取總RNA，采用分光光度法檢測(cè)OD260/280，比值均符合要求。
　　2、總RNA與miRNA芯片雜交
　　用實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交，得到2張成像均勻、清晰的雜交圖像，可證實(shí)總RNA中含有miRNAs。
　　3、miRNAs在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中表達(dá)存在差異
　　采用GenePix pro V6.0軟件，

5、對(duì)探針點(diǎn)的初始熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，然后對(duì)初始強(qiáng)度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出兩組間差異表達(dá)的miRNAs。以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界，共有31種差異表達(dá)的miRNAs，其中21種在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào),10種下調(diào)。
　　4、篩選出兩種候選miRNAs
　　以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界，選擇P值＜0.001以及信號(hào)值大于500，最后篩選出兩種miRNA進(jìn)行第三部分實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分：
　　1、各視網(wǎng)膜標(biāo)本中均可提取

6、出合格的RNA兩組視網(wǎng)膜標(biāo)本提取總RNA，OD260/280的比值均符合要求。
　　2、候選miRNAs的初步驗(yàn)證與篩選以U6 SnRNA為內(nèi)參，對(duì)各miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，第二部分實(shí)驗(yàn)中篩選出的miRNA-130a-3p、miRNA-5107-5p在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)存在顯著性差異，與芯片結(jié)果一致。
　　第四部分：對(duì)miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析，

7、發(fā)現(xiàn)miR-5107-5p靶基因顯著富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,甲狀腺癌通路。miR-130a-3p靶基因顯著富集于甘油脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、Notch信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、甘油磷脂代謝等通路中。
　　結(jié)論:
　　1、通過氧誘導(dǎo)方法，可以成功建立OIR模型。
　　2、芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，某些 miRNAs的組織表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間存在顯著性差異,本實(shí)驗(yàn)篩選出67種差異表達(dá)的miRNA，其中35種在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)