丹皮酚增強表柔比星抗腫瘤活性、降低其毒性的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗主要探討丹皮酚是否能增強表柔比星的抗乳腺癌活性及其具體的作用機制，是否能減輕表柔比星誘導的心臟、肝臟和腎臟毒性及其具體作用機制。
　　方法：
　　1.丹皮酚增強表柔比星體外抗乳腺癌活性的研究
　　選用小鼠乳腺癌細胞株4T1及人乳腺癌細胞株MCF-7，MTT法檢測不同濃度的丹皮酚或/和表柔比星對乳腺癌細胞增殖的抑制作用，計算出聯(lián)合用藥指數(shù)，評價聯(lián)合用藥效果。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法、

2、Hochest33258檢測丹皮酚或/和表柔比星對乳腺癌細胞凋亡的影響。Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達的影響。最后檢測p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表達，探討丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺癌細胞增殖可能介導的信號轉導通路。
　　2.丹皮酚增強表柔比星體內抗乳腺癌活性的研究
　　選Balb

3、/c小鼠第四對右側乳腺注射4T1癌細胞，建立小鼠原位乳腺癌模型。待腫瘤長到約100 mm3時，給予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾靜脈注射，兩天一次，共八次。每次給藥后測量腫瘤長和寬，計算腫瘤體積。最后一次給藥后，取腫瘤稱重，計算藥物的抑瘤率及聯(lián)合用藥指數(shù)。取腫瘤組織做免疫組化檢測微血管生成，TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡，Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白clea

4、ved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達的影響。最后檢測p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表達，探討丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺腫瘤生長可能介導的信號轉導通路。
　　3.丹皮酚降低表柔比星誘導的小鼠心臟毒性的研究
　　建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待腫瘤長到約100 mm3時，給予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾靜脈注射，兩

5、天一次，共八次。每次給藥后，稱量記錄小鼠體重。最后一次給藥后，取血漿及心臟組織稱重，計算體重以及心臟重量/體重的比值。檢測血漿中LDH、AST、CK和CK-MB的表達，心肌組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色觀察心肌組織病理學變化，TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡，qRT-PCR檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的變化，Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleav

6、ed PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達的影響。最后檢測NF-κB通路中主要蛋白的表達，探討丹皮酚降低表柔比星誘導的心臟毒性可能介導的信號轉導通路。
　　4.丹皮酚降低表柔比星誘導的小鼠肝臟毒性的研究
　　體外選用原代肝細胞，MTT法檢測不同濃度的丹皮酚或/和表柔比星對其增殖的抑制作用，評價表柔比星的毒性作用及丹皮酚降低表柔比星的毒性作用。建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待腫瘤長到

7、大約100 mm3時，給予丹皮酚(20mg/kg)灌胃3天，每天一次，和/或第四天的表柔比星(9 mg/kg)尾靜脈注射。最后一次給藥后，稱體重，取血漿及肝臟組織稱重，計算體重以及肝臟重量/體重的比值。檢測血漿中ALT、AST、ALP和GGT的表達，肝臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色觀察肝臟組織病理學變化，TUNEL染色檢測肝臟細胞凋亡，qRT-PCR檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的變

8、化，Western blotting檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及cytochrome c表達的影響。最后檢測PI3K/Akt/NF-κB通路中主要蛋白的表達，探討丹皮酚降低表柔比星誘導的肝臟毒性可能介導的信號轉導通路。
　　結果：
　　1.丹皮酚增強表柔比星體外抗乳腺癌活性
　　MTT結果顯示，表柔比星對4T1和MCF-7乳腺癌細胞

9、具有劑量依賴性抑制作用，IC50值分別為2.05μM和1.98μM，CDI分別為0.59到0.82，0.63到0.84，均小于1，表明丹皮酚能增強表柔比星抗乳腺癌細胞增殖的活性。丹皮酚(0.2 mM)和/或表柔比星（4μM）孵育4T1細胞48 h，Hoechst33258染色顯示，表柔比星組、聯(lián)合用藥組出現(xiàn)明顯的細胞凋亡特征，包括細胞核固縮、細胞膜完整性缺失或呈現(xiàn)核分裂。流式結果顯示，與對照組相比，表柔比星和聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯增多

10、，分別為37.7％和51.5％。Western blotting結果顯示，相對于對照組，表柔比星顯著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的表達。在對照組、表柔比星組和聯(lián)合用藥組，p-p38、p-JNK和p-ERK的表達依次降低，并具有統(tǒng)計學意義，而總的p38、JNK和ERK表達并無明顯變化。
　　2.丹皮酚增強表柔比星體內抗乳腺癌活性
　　對照組、丹皮酚組、表

11、柔比星組及聯(lián)合用藥組的小鼠腫瘤體積分別823.93mm3、709.1 mm3、284.16mm3和160.34 mm3。丹皮酚組、表柔比星組及聯(lián)合用藥組的抑瘤率分別為9.15％、65.04％和73.63％。兩藥聯(lián)用的理論聯(lián)合效應為0.6171，小于實際聯(lián)合效應0.7363，表明丹皮酚與表柔比星具有協(xié)同抗腫瘤作用。免疫組化結果顯示表柔比星組相對于對照組，VEGF和CD31的表達減少，而聯(lián)合用藥組兩者表達更少。TUNEL染色結果顯示丹皮酚、

12、表柔比星及聯(lián)合用藥的細胞凋亡率分別為24.67％、59.83％和76.67％。表柔比星顯著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的表達。在對照組、表柔比星組和聯(lián)合用藥組，p-p38、p-JNK和p-ERK的表達依次降低，并具有統(tǒng)計學意義，而總的p38、JNK和ERK表達并無明顯變化。
　　3.丹皮酚降低表柔比星誘導的小鼠心臟毒性
　　與對照組、丹皮酚組相比，表柔

13、比星組的小鼠體重明顯減輕，絕對和相對心臟重量明顯的增加。表柔比星給藥后，血漿中LDH、AST、CK和CK-MB的水平明顯增加，心臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，與對照組都有顯著的變化。HE染色呈現(xiàn)出嚴重的心臟損傷，包括胞質空泡的形成、心肌纖維腫脹和間質出血。TUNEL染色表現(xiàn)出明顯的心肌細胞的凋亡。在聯(lián)合用藥組，以上變化都有所改善。Westernblottin

14、g結果顯示，表柔比星組與對照組相比較，顯著增加了心肌組織中凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的表達。增加P-NF-κB的表達，降低IκBα的表達。聯(lián)合用藥組則抑制了凋亡蛋白的表達和NF-κB通路的活性。
　　4.丹皮酚降低表柔比星誘導的小鼠肝臟毒性
　　MTT結果顯示表柔比星對原代肝細胞具有的毒性作用，而丹皮酚能降低表柔比星誘導的毒性作用。對照組和丹皮酚組的小鼠

15、體重、肝臟體重、肝臟/體重比值并無差異。表柔比星組的小鼠體重有明顯減輕、絕對和相對肝臟重量則有明顯的增加。而聯(lián)合用藥組與前者相比，呈相反的趨勢。表柔比星給藥后血漿中ALT、AST、ALP和GGT的表達，肝臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，與對照組都有顯著的變化。HE染色呈現(xiàn)出嚴重的肝臟損傷，包括肝細胞壞死、炎性細胞浸潤和間質出血。表柔比星給藥后，TUNEL染色也

16、表現(xiàn)出明顯的肝臟細胞凋亡。Westem blotting結果顯示，表柔比星組與對照組相比較，顯著增加了肝臟組織中凋亡蛋白cleavedPARP，cleaved caspase-3、cytochrome c和Bax的表達，降低Bcl-2的表達，增強PI3K/Akt/NF-κB主要蛋白的表達。相對于表柔比星組，聯(lián)合用藥組的肝損傷有明顯地改善，凋亡蛋白的表達及PI3K/Akt/NF-κB通路的活性有明顯的抑制。
　　結論：
　　1

17、.丹皮酚能增強表柔比星體外、體內的抗乳腺癌細胞增殖的活性，其增效作用與抑制乳腺癌細胞中p38/JNK/ERK MAPK信號通路有關。
　　2.丹皮酚能降低表柔比星誘導的心臟毒性，其保護作用與抑制心臟組織中NF-κB信號通路有關。
　　3.丹皮酚能降低表柔比星誘導的肝臟毒性，其保護作用與抑制肝臟組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路有關。
　　4.丹皮酚能降低表柔比星誘導的腎臟毒性，其保護作用與抑制肝臟組織中NF-κ