白藜蘆醇增強抗腫瘤藥物活性的機制研究.pdf

1、腫瘤化學(xué)治療最大障礙之一是腫瘤細胞對藥物的耐受性。為了減少腫瘤耐藥性的產(chǎn)生、降低藥物毒副作用、增強藥物療效，一般采用聯(lián)合用藥。聯(lián)合用藥是近年來治療腫瘤的重要進展之一，已成為腫瘤治療的趨勢，并得到廣泛的應(yīng)用。
　　 白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是植物產(chǎn)生的一種抗毒素，是非黃酮類多酚天然化合物，具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤等生物活性。白藜蘆醇在抗腫瘤及心血管疾病方面具有非常巨大的應(yīng)用價值。
　　 吉西他濱（Gem

2、citabine，GEM）化學(xué)名稱為雙氟脫氧胞苷，是脫氧胞嘧啶類似物，在細胞內(nèi)活化后參入DNA合成，同時抑制核苷酸還原酶和脫氧胞嘧啶脫氨酶活性，是細胞周期特異性抗代謝類藥物。
　　 本研究研探索了白藜蘆醇增強吉西他濱體內(nèi)外抗腫瘤療效，及其增效作用的分子機制，為提高吉西他濱的臨床抗腫瘤效果，減少不良反應(yīng)發(fā)生提供指導(dǎo)意義。同時，對白藜蘆醇增強DNA損傷藥物抗腫瘤活性，及幾個白藜蘆醇新衍生物的抗腫瘤效果進行了初探性研究。
　　

3、 1.RES增強GEM對多種細胞系的體外生長抑制作用
　　 我們選用低劑量吉西他濱與白藜蘆醇聯(lián)合作用于11種細胞，包括人正常細胞系：人胚肺成纖維細胞系2BS，人肝細胞系LO2；人腫瘤細胞系：人肝癌細胞系HepG2和Be1-7402，人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549，人結(jié)腸癌細胞系HCT116（包括p53野生型wild type，wt和p53突變型mutant，ko），人喉癌系KB及其耐藥株KBV，人子宮頸癌細胞系HeLa；小鼠肝癌細

4、胞系H22。我們發(fā)現(xiàn)RES不會增強GEM對正常細胞（2BS、LO2）的生長抑制作用，即藥物合用降低了GEM對正常細胞的毒性；RES與GEM合用除了對HeLa、HCT116 wt細胞沒有增效作用，對其他幾株細胞均有不同程度的協(xié)同增效作用，尤其對HepG2細胞的增效作用最為顯著。20μM RES與0.5μM GEM聯(lián)合用藥指數(shù)CI值為0.52，具有顯著協(xié)同增效作用。
　　 接下來我們在小鼠體內(nèi)檢測了RES聯(lián)合GEM對H22移植瘤的體

5、內(nèi)生長抑制增效作用。結(jié)果表明RES（10 mg/kg）與GEM（25 mg/kg）低劑量合用，兩藥合用CI為0.73：RES（10mg/kg）與GEM（50mg/kg）高劑量合用，兩藥合用CI為0.56，RES與GEM合用體內(nèi)抑瘤協(xié)同作用非常顯著。
　　 2.RES增強GEM誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡作用
　　 我們使用染色質(zhì)凝集、流式檢測PI染色、western blot幾種實驗方法，證明了RES能增強GEM誘導(dǎo)Hep

6、G2細胞凋亡的作用。20μM RES使0.5μM GEM誘導(dǎo)的HepG2凋亡細胞比例顯著升高。
　　 3.RES增強GEM誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡作用機制
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)RES能增強GEM體內(nèi)外抗肝癌作用。接著我們進一步研究了增效作用的機制。結(jié)果表明RES增強GEM對HepG2細胞抑制作用不依賴于SIRT1、p53；RES增強GEM對HepG2細胞抑制作用與RES增強GEM誘導(dǎo)的HepG2細胞S期周期阻滯，及細胞

7、內(nèi)ROS水平升高有關(guān)；RES能下調(diào)HepG2內(nèi)NF-kB表達水平，上調(diào)NF-κB抑制因子IκBα蛋白水平；且RES與GEM合用后，能顯著下調(diào)NF-κB下游促存活靶蛋白：Survivin、Bcl-2、Bcl-xL、c-myc、Cyclin D1表達水平，上調(diào)促凋亡蛋白因子Bax蛋白水平，表明RES通過調(diào)節(jié)NF-kB及其靶蛋白水平來增強GEM對HepG2細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　 4.較低劑量下合用，RES增強GEM誘導(dǎo)肝癌HepG

8、2細胞衰老樣表型（SLP）發(fā)生
　　 我們使用低劑量RES（10μM）與低劑量GEM（0.05μM、0.1μM）和用處理HepG2細胞發(fā)現(xiàn)，在選用合用劑量下，RES沒有增強GEM誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡，而是促使HepG2細胞衰老，生長停滯。因此低劑量下合用，RES同樣增強了GEM對HepG2細胞的生長抑制作用。
　　 5.RES增強DNA損傷藥物抗腫瘤活性
　　 接著我們又探索了RES與DNA損傷藥物：博萊霉素

9、（Bleomycin，BLM）、博安霉素（Boanmycin，BAM）、NC0604、多柔比星（DOX）聯(lián)合用藥對幾株細胞的生長抑制作用。結(jié)果表明RES與博萊霉素家族抗生素聯(lián)合作用于HepG2細胞，在一定濃度范圍內(nèi)具有協(xié)同增效作用，但增效作用并不顯著；與DNA斷裂藥物DOX聯(lián)合作用于HepG2細胞具有顯著增效作用；RES與BAM、NC0604、DOX聯(lián)用于Be1-7402細胞，也具有一定的協(xié)同增效作用，而RES與BAM聯(lián)合用作用于HeL

10、a細胞，CI值均大于1，表明兩藥合用拮抗，這與RES、GEM聯(lián)合處理HeLa細胞結(jié)果相似，表明HeLa細胞對RES與GEM、BAM合用并不敏感，反而耐受。
　　 RES與BAM聯(lián)合用藥對小鼠體內(nèi)H22移植瘤的抑制研究結(jié)果表明，RES（10mg/kg）、BAM（10 mg/kg）聯(lián)合用藥組與BAM（10 mg/kg）單藥組相比較，小鼠瘤重有顯著差異（P<0.05），聯(lián)合用藥指數(shù)CI值為0.73，具有協(xié)同增效作用。
　　 同

11、時我們對NC0604抗腫瘤活性機制進行了初步探索，發(fā)現(xiàn)NC0604能損傷HepG2細胞DNA，通過影響調(diào)控細胞凋亡、存活的蛋白因子表達水平，來誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。
　　 6.三種白藜蘆醇衍生物抗腫瘤活性及聯(lián)合用藥初探
　　 白藜蘆醇衍生物B1、B4、B5對HepG2細胞具有不同程度的生長抑制作用。其中B1、B4，尤其B4，抑瘤效果顯著強于RES，具有進一步研究、開發(fā)的價值。接著我們將抑瘤效果相對較差的B1、B5與GEM、D