鼠傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)理研究.pdf

1、自噬是真核生物進(jìn)化上相對(duì)保守的細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程，其主要功能是清除受損細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白以及入侵的病原菌。自噬始于雙層膜囊泡自噬小體的產(chǎn)生，其不斷延伸包圍周圍細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞器，最終通過(guò)與溶酶體的融合降解底物從而實(shí)現(xiàn)小分子的循環(huán)再利用。自噬以非選擇性和選擇性兩種方式降解底物。自噬作為天然免疫的一部分保護(hù)細(xì)胞受損。自噬的調(diào)控機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，mTOR和AMPK兩個(gè)激酶在自噬中起重要重要。mTOR是自噬的負(fù)調(diào)控分子并發(fā)揮“門(mén)衛(wèi)”作用。AMPK被認(rèn)

2、為是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的開(kāi)關(guān)，細(xì)胞自噬的感受器。AMPK和mTOR分別感知能量壓力和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗。AMPK通過(guò)上游的LKB1激活。本實(shí)驗(yàn)室的最近研究發(fā)現(xiàn)，TAK1，也能激活A(yù)MPK。 AMPK磷酸化ULK1 S555位點(diǎn)并激活ULK1。mTOR與多個(gè)互作蛋白結(jié)合形成mTOR復(fù)合體1(mTORC1)，mTORC1可磷酸化ULK1/28757位點(diǎn)從而抑制其活性。營(yíng)養(yǎng)缺乏或mTOR抑制劑雷帕霉素抑制mTORC1活性激活ULK1并誘導(dǎo)自噬。

3、>　　自噬作為細(xì)胞抵抗胞內(nèi)病原菌的第一道防線，與天然免疫協(xié)同作用，共同抵御細(xì)菌入侵，在病理生理學(xué)上具有重要意義。鼠傷寒沙門(mén)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，該菌是引起腸炎的最常見(jiàn)的沙門(mén)菌。沙門(mén)菌入侵胞內(nèi)后形成沙門(mén)菌囊泡(Salmonella containing vesicle，SCV)并在其內(nèi)增殖。部分囊泡由于沙門(mén)菌釋放的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白導(dǎo)致囊泡的胞膜受損，細(xì)菌進(jìn)入胞漿后激活選擇性自噬。但沙門(mén)菌激活自噬的機(jī)理并不是很清楚，特別是AMPK和m

4、TOR兩個(gè)重要的調(diào)控自噬的激酶是調(diào)控沙門(mén)菌誘導(dǎo)的自噬存在很大的爭(zhēng)議。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為模式細(xì)胞，研究鼠傷寒沙門(mén)菌能否誘導(dǎo)自噬發(fā)生，探究自噬發(fā)生的機(jī)制以及自噬在鼠傷寒沙門(mén)菌胞內(nèi)增殖中的作用。
　　首先，我們利用Western blot技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌感染下的RAW264.7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的LC3和p62的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè);利用共聚焦顯微鏡觀察自噬是否可以靶向入侵的鼠傷寒沙門(mén)菌，即紅色

5、熒光細(xì)菌是否與GFP-LC3共定位;對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌以及自噬抑制劑氯喹(CQ)和巴弗洛霉素(bafilomycin A1)處理的HeLa細(xì)胞中的LC3表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門(mén)菌增加RAW264.7和HeLa細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值但降低p62的表達(dá)水平;CQ和bafilomycin A1能進(jìn)一步增加鼠傷寒沙門(mén)菌作感染后的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值;GFP-LC3與RFP標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)菌在HeLa細(xì)胞中共定位。這些

6、結(jié)果表明自噬的確可以靶向入侵的鼠傷寒沙門(mén)菌。
　　其次，我們利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了不同MOI鼠傷寒沙門(mén)菌感染不同時(shí)間下與自噬相關(guān)的信號(hào)通路中的蛋白磷酸化水平(AMPK、ULK、mTOR、S6K1、S6)，檢測(cè)了AMPK抑制劑Compound C和TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol預(yù)處理鼠傷寒沙門(mén)菌作用下細(xì)胞AMPK和ULK蛋白的磷酸化水平以及LC3和p62的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門(mén)菌抑制HeLa細(xì)胞

7、中但增加了RAW264.7細(xì)胞中mTOR、S6K1和S6蛋白的磷酸化。鼠傷寒沙門(mén)菌增加RAW264.7和HeLa細(xì)胞中AMPKT172的磷酸化。鼠傷寒沙門(mén)菌增加了RAW264.7細(xì)胞但抑制了HeLa細(xì)胞中ULKS555的磷酸化，Compound C與5Z-7-oxozeaenol可抑制鼠傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)的RAW247.6細(xì)胞中AMPK和ULK的磷酸化。
　　最后，我們利用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)AMPK在鼠傷寒沙門(mén)菌自噬中的作用進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯