傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)DC成熟及其自噬過程和免疫功能的影響.pdf

1、傷寒（typhiod fever）又稱為腸熱?。╡nteric fever），是一種古老的由傷寒沙門菌（Salmonella typhi，S.typhi）引起的急性腸道傳染病。20世紀(jì)80年代末至90年代初，我國(guó)十三省市曾發(fā)生大規(guī)模多重耐藥傷寒沙門菌的暴發(fā)流行。對(duì)591例傷寒沙門菌臨床分離株進(jìn)行藥敏、質(zhì)粒電泳、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化及消除試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，流行期間分離的多重耐藥菌株均含一分子量98.6×106道爾頓（98.6 Md，約159 Kb）的

2、耐藥質(zhì)粒，可編碼對(duì)多種藥物的抗性，屬不相容性C群（IncC），稱之為pRST98。該質(zhì)粒具有多效性，除編碼抗藥性外還能增強(qiáng)宿主菌的毒力，是一種既能介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性又能增強(qiáng)細(xì)菌毒力的具有雙重功能的“嵌合型”質(zhì)粒。傷寒沙門菌是兼性胞內(nèi)致病菌，具有靶向感染專職抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）的特點(diǎn)，侵入機(jī)體后可定居在樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。DC是連接天然免疫和獲得性免疫的

3、橋梁，在抗沙門菌感染免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，任何對(duì)DC功能的干擾都可能影響感染結(jié)局。
　　本研究通過建立沙門菌感染的細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對(duì)DC成熟及其自噬過程和免疫功能的影響，揭示其增強(qiáng)宿主菌毒力的發(fā)生機(jī)理，為下一步繼續(xù)深入研究質(zhì)粒的毒力機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　第一部分，傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)DC成熟和自噬過程影響的體外實(shí)驗(yàn)
　　以攜帶 pRST98的野生株 S.typhi-WT、消除

4、 pRST98的傷寒沙門菌突變株S.typhi-Δ-pRST98以及 pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入 S.typhi-Δ-pRST98所獲得的回補(bǔ)株S.typhi-c-pRST98為研究對(duì)象，將細(xì)菌與小鼠骨髓來源的 DC（bone marrow-derived DC，BMDC）共培養(yǎng)建立體外感染模型。分別在感染的不同時(shí)間段（2 h、4 h、12 h和24 h）收獲細(xì)胞，采用以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：①流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry

5、， FCM）檢測(cè)DC表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)以及DC的吞噬能力；②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）及Th2型細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)；③ Western Blot（WB）檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3

6、-II（Microtubule-associated protein1 light chain3-II， MAP1-LC3-II，即LC3-II）和Beclin-1的表達(dá)；④透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，① S.typhi-WT感染組DC表面CD40、CD80和CD86的表達(dá)量均顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.05

7、，P<0.01，P<0.01）；S.typhi-c-pRST98感染組與 S.typhi-Δ-pRST98感染組比較， CD40和 CD86的表達(dá)量均顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.05）；S.typhi-WT感染組和S.typhi-c-pRST98感染組DC的吞噬率均顯著高于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.05）；② S.typhi-WT感染組DC的IFN-g和IL-12的分泌量均顯著低于S

8、.typhi-Δ-pRST98感染組（P均<0.01），而IL-10分泌量顯著高于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.05），S.typhi-c-pRST98感染后，除了 IL-10的分泌量與 S.typhi-Δ-pRST98感染組無顯著差異外（P>0.05），IFN-g和IL-12分泌量顯著低于S.typhi-Δ-pRST98感染組（P<0.01，P<0.05）；③ S.typhi-Δ-pRST98感染細(xì)胞Beclin-1

9、的表達(dá)量顯著高于S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染組，同時(shí)S.typhi-Δ-pRST98感染細(xì)胞LC3-II表達(dá)增強(qiáng)，而S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染組LC3-II僅有微弱表達(dá)；④ S.typhi-Δ-pRST98感染DC內(nèi)可見典型的自噬小體。感染后2h和4h有部分細(xì)菌被雙層或多層膜包裹形成自噬泡，多層膜包裹S.typhi-Δ-pRST98形成的自噬小體于感染后12 h與溶酶體融合形

10、成自噬溶酶體，感染后24 h觀察到內(nèi)化的細(xì)菌被降解。攜帶嵌合型質(zhì)粒pRST98的S.typhi-WT感染DC內(nèi)未觀察到自噬小體結(jié)構(gòu)。
　　第二部分，傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)免疫功能影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　感染的發(fā)生和發(fā)展過程極其復(fù)雜，體內(nèi)多種因素參與調(diào)節(jié)并決定感染的結(jié)局，建立動(dòng)物模型能進(jìn)一步揭示致病菌與宿主相互作用。傷寒沙門菌是一種嚴(yán)格只對(duì)人類致病的病原體，沒有合適的動(dòng)物模型和有效的遺傳學(xué)工具，本研究利用與其有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門菌

11、（S.typhimurium）的研究途徑來研究pRST98質(zhì)粒毒力基因。
　　S.typhimurium SR-11是攜帶一分子量為100 kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株，本研究將SR-11毒力質(zhì)粒消除后得到的菌株χ3337作為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pRST98經(jīng)接合導(dǎo)入χ3337形成接合子χ3337/pRST98為研究對(duì)象，按以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①如第一部分建立體外感染模型，于感染后2 h收集DC，分別進(jìn)行細(xì)胞破膜活菌計(jì)數(shù)和Annex

12、in V-FITC/ PI雙染FCM檢測(cè)，觀察不同菌株侵襲DC的能力及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；②將實(shí)驗(yàn)菌株尾靜脈感染小鼠，于不同時(shí)間段（1 d、3 d、5 d和10 d）處死小鼠，收獲脾細(xì)胞懸液，F(xiàn)CM檢測(cè)脾臟DC的數(shù)量及表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)；脾臟DC胞內(nèi)細(xì)胞因子TNF-a、IL-12和IFN-g的分泌水平；脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞活化指標(biāo)CD44和CD62L的表達(dá)情況；③平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)感染后肝臟和脾臟內(nèi)活

13、菌數(shù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①感染2 h，χ3337和χ3337/pRST98感染組DC內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無顯著性差別（P>0.05）；χ3337/pRST98感染組凋亡率顯著高于χ3337感染組（P<0.05）；② S.typhimurium感染后小鼠脾臟細(xì)胞總數(shù)在感染χ3337后3 d、5 d和10 d明顯增多（P<0.01，P<0.05，P<0.01）；感染3 d開始，DC絕對(duì)數(shù)量高于control組（P<0.01）；DC絕對(duì)數(shù)量和百

14、分比在感染5 d（P<0.01，P<0.05）和10 d（P均<0.05）均高于control組；感染χ3337/pRST98后3 d，脾細(xì)胞總數(shù)顯著高于未感染組（P<0.05）；感染5 d，細(xì)胞總數(shù)、DC絕對(duì)數(shù)量和百分比均顯著升高（P均<0.05）；感染10 d，脾細(xì)胞總數(shù)和DC絕對(duì)數(shù)量仍均顯著高于control組（P均<0.05）；χ3337感染組小鼠在感染后5 d，CD11c+DC絕對(duì)數(shù)量以及相對(duì)數(shù)量都顯著高于χ3337/pRST

15、98感染組（P均<0.05）；小鼠感染S.typhimurium后，CD40、CD80、CD86和 MHCⅡ的表達(dá)量均顯著增加；χ3337/pRST98感染組與χ3337感染組比較，CD11c+DC除了CD40的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)量均顯著低于χ3337感染組（P<0.05，P<0.01，P<0.05）；S.typhimurium感染后，小鼠脾臟 CD11c+DC的TNF-a、IL-12和

16、IFN-g分泌量顯著增加；χ3337/pRST98感染組小鼠脾臟CD11c+DC的IL-12和IFN-g分泌量顯著低于χ3337組（P均<0.05），不同菌株感染組間TNF-a的分泌量無顯著差異（P>0.05）；③對(duì)照組小鼠、感染χ3337小鼠和感染χ3337/pRST98小鼠脾臟中CD3+CD4+Th細(xì)胞和CD3+CD8+Tc細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中所占比例這兩項(xiàng)指標(biāo)均無差異（P>0.05）；χ3337和χ3337/pRST98感染后10 d

17、淋巴細(xì)胞表面CD44表達(dá)量顯著增高（P均<0.05）；淋巴細(xì)胞CD62LlowT細(xì)胞群比例顯著增加（P均<0.05）；χ3337感染組小鼠在感染后10 d，CD44high和CD62Llow T細(xì)胞比例都顯著高于χ3337/pRST98感染組（P均<0.05）；細(xì)菌感染第10 d，兩組小鼠肝臟和脾臟的活菌數(shù)均達(dá)到較高水平，χ3337組的肝臟、脾臟活菌數(shù)明顯低于χ3337/pRST98組（P均<0.05）。
　　結(jié)論
　　1．

18、傷寒沙門菌質(zhì)粒 pRST98對(duì)宿主菌侵襲 DC的能力未見明顯改變，但能抑制DC自噬，誘導(dǎo)凋亡，促進(jìn)細(xì)菌在DC內(nèi)的存活和增殖，從而加重細(xì)胞損傷。
　　2．傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能影響DC分泌細(xì)胞因子的水平，抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，表明質(zhì)粒pRST98具有轉(zhuǎn)換不同免疫應(yīng)答類型的能力，使宿主菌毒力增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。
　　3．?dāng)y帶 pRST98質(zhì)粒的沙門菌毒力株能通過抑制