傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞自噬通量的影響和作用時相的研究.pdf

1、目的：
　　研究傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar typhi, S.typhi）質(zhì)粒pRST98對巨噬細胞自噬動態(tài)過程的影響，探討該質(zhì)粒與沙門菌感染時巨噬細胞自噬體及自噬溶酶體的關系，揭示pRST98對自噬通量（autophagic flux）的作用時相，為通過調(diào)控細胞自噬水平來防治細菌感染的新策略及新藥研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞自噬的影響<

2、br>　　以攜帶 pRST98的傷寒沙門菌野生株 ST8，消除 pRST98的傷寒沙門菌突變株ST8-ΔpRST98和將 pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導入 ST8-ΔpRST98所獲得的回補株ST8-c-pRST98，按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）100:1感染小鼠腹腔巨噬細胞J774A.1，建立細胞感染模型，同時設自噬誘導劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干預組。分別于細胞感染后1~3

3、h收集細胞，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細胞超微結(jié)構(gòu)；流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）和免疫印跡法（western blot，WB）檢測自噬蛋白LC3-II、Beclin-1的表達；用紅色和綠色熒光蛋白偶聯(lián)的LC3真核細胞表達載體mRFP-GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染巨噬細胞，共聚焦激光顯微鏡（confocal laser scanning microscope，C

4、LSM）觀察LC3-II點狀聚集，并用免疫組化法做平行對照；平板菌落計數(shù)法檢測胞內(nèi)活菌數(shù)（colony-forming unit， CFU）。
　　二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞自噬通量及作用時相的影響
　　由于傷寒沙門菌的嚴格宿主特異性，使其缺乏理想的動物模型，為今后進一步在動物活體內(nèi)研究pRST98與細胞自噬的關系，本部分實驗用與傷寒沙門菌有非常近緣關系的鼠傷寒沙門菌作為研究對象，研究該質(zhì)粒對巨噬細胞自噬通量的影響。以攜帶

5、一分子量為100 kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium）標準毒株χ3306、將其質(zhì)粒消除后獲得的鼠傷寒沙門菌突變株χ3337和將質(zhì)粒pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導入χ3337后形成的鼠傷寒沙門菌接合子χ3337/pRST98為受試菌，同第一部分建立感染模型。分別設饑餓誘導組（無血清RPMI1640培養(yǎng)液處理細胞）、溶酶體抑制劑氯喹（chloroq

6、uine，CQ）干預組和常規(guī)細胞感染模型組。于感染后1 h收集細胞，用Giemsa染色法觀察各感染組細胞狀態(tài)及感染情況；CLSM觀察轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3的巨噬細胞內(nèi)自噬蛋白LC3-II的點狀聚集；WB檢測自噬標記蛋白 LC3-II及自噬底物蛋白 p62的表達；將熒光素酶報告基因 lux導入以上3株受試菌染色體，獲得發(fā)光菌χ3306lux、χ3337lux及χ3337/pRST98lux，用小動物成像儀檢測相應細菌的生物發(fā)光量，直

7、接分析感染細胞內(nèi)CFU。
　　結(jié)果：
　　一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞自噬的影響
　?。?）TEM結(jié)果顯示，感染后1~3 h，ST8-ΔpRST98感染組細胞中可觀察到典型的自噬體和自噬溶酶體；ST8和ST8-c-pRST98感染組少見或未見到上述結(jié)構(gòu)，但可見大量細菌的存在。
　?。?）CLSM檢測LC3點狀結(jié)構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8-ΔpRST98感染組細胞內(nèi)LC3點狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯高于ST8和ST8

8、-c-pRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預后，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞內(nèi)點狀結(jié)構(gòu)均有增加（p<0.05），但各感染組之間無顯著差異。
　　（3）FCM和WB檢測結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細胞自噬蛋白LC3-II和Beclin-1的表達量均低于ST8-ΔpRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預后，ST8和ST8-c-pRST98感染組LC3-II、Beclin

9、-1的表達量均增加（p<0.05），但各感染組之間無顯著差異。
　　（4）平板菌落計數(shù)法計數(shù)胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8和ST8-c-pRST98感染組胞內(nèi)CFU高于ST8-ΔpRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預后，趨勢不變。感染后3 h，RAPA干預的ST8和ST8-c-pRST98感染組胞內(nèi)CFU減少均低于未干預組（p<0.05），而ST8-ΔpRST98感染組未見顯著變化。
　　二、傷寒沙門菌質(zhì)

10、粒對巨噬細胞自噬通量及作用時相的影響
　?。?）Giemsa染色結(jié)果顯示，感染后1 h，常規(guī)感染組細胞內(nèi)未見或少見空泡，所見空泡內(nèi)常包裹細菌；CQ干預后，細胞質(zhì)中呈現(xiàn)均勻空泡，細胞略有腫脹，各感染組胞內(nèi)細菌增多；饑餓誘導下，巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)不均勻的空泡，胞內(nèi)細菌量低于未誘導組。
　?。?）CLSM檢測結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3337感染組細胞內(nèi)黃色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬體）多于χ3306和χ3337/pRST98感染組，CQ干預

11、后黃色熒光差異更加顯著；紅色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬溶酶體）則未見明顯差異；饑餓誘導后，χ3337感染組平均每個細胞中自噬體顯著多于χ3306和χ3337/pRST98感染組（p<0.01），自噬溶酶體各感染組差別無統(tǒng)計學意義。
　?。?）WB檢測結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3337感染組細胞LC3-II表達量高于χ3306和χ3337/pRST98感染組，而p62表達量則低于后兩組；CQ干預后，各組感染細胞LC3-II表達差異與常規(guī)感染

12、模型一致，即χ3337感染組細胞高于χ3306和χ3337/pRST98感染組，但差異更加顯著，p62表達水平各感染組間差異不顯著。
　　（4）小動物成像儀檢測胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3306和χ3337/pRST98感染組胞內(nèi)CFU顯著高于χ3337感染組（p<0.05）；CQ干預后，各感染組胞內(nèi)CFU無顯著差異。饑餓誘導后，χ3306和χ3337/pRST98感染組胞內(nèi)CFU均低于未誘導對照組（p<0.01）。