傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：
　　通過(guò)建立傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.typhi）感染的細(xì)胞模型，用自噬阻斷劑氯喹（chloroquine，CQ）和Beclin1過(guò)表達(dá)技術(shù)，研究傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pRST98對(duì)人巨噬細(xì)胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步闡明該質(zhì)粒增強(qiáng)宿主菌毒力的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬過(guò)程的影響<

2、br>　　1. CQ對(duì)THP-1細(xì)胞自噬阻斷濃度的確定
　　CQ是一種治療瘧疾的藥物，近年來(lái)被廣泛用作自噬阻斷劑，它通過(guò)提高溶酶體的pH值使酸性水解酶失活，導(dǎo)致自噬溶酶體無(wú)法分解底物，造成自噬相關(guān)蛋白的累積。本實(shí)驗(yàn)以0、10、20、30、40、50、60、70和80μM CQ的培養(yǎng)液作用THP-1細(xì)胞6 h，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（western blot，WB）檢測(cè)自噬底物蛋白p62的累積水平；作用細(xì)胞24 h后，用噻唑藍(lán)還原法（me

3、thyl thiazolyl tetrazolium， MTT）檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　2. CQ對(duì)受試菌的影響
　　用上述方法測(cè)定的CQ適宜濃度作用受試菌24 h，OD600測(cè)定菌液濃度，檢測(cè)該濃度CQ對(duì)細(xì)菌的影響。
　　3. CQ對(duì)THP-1細(xì)胞感染模型自噬的影響
　　由于傷寒沙門(mén)菌只感染人類的嚴(yán)格宿主特異性，本實(shí)驗(yàn)以攜帶傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pRST98的野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-ΔpRST98和

4、將pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入的回補(bǔ)株 ST8-c-pRST98為受試菌，分別與人巨噬細(xì)胞 THP-1共培養(yǎng)建立感染模型。用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）50:1感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立自噬阻斷劑CQ干預(yù)組。將細(xì)菌與細(xì)胞共作用1 h后吸取上清，加入含100μg/ml的阿米卡星（amikacin，AMK）培養(yǎng)液作用2 h以去除胞外菌，將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細(xì)胞中釋放至

5、培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長(zhǎng)。分別在感染的1 h和3 h收獲細(xì)胞：①WB檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（microtubule-associated protein1 light chain3-II，MAP1-LC3-II）及自噬底物蛋白p62表達(dá)；②將帶有紅色和綠色熒光的mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀

6、察細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體的變化。
　　二、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1凋亡和炎癥反應(yīng)的影響
　　beclin1基因是第一個(gè)被確認(rèn)的哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控基因，其編碼產(chǎn)物Beclin1是自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白。本部分實(shí)驗(yàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將外源性 beclin1基因?qū)隩HP-1細(xì)胞，研究Beclin l蛋白過(guò)表達(dá)后傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。感染模型建立同第一部分，分別設(shè)野生株ST8、突變株ST8-ΔpRST98和

7、回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染的Beclin1過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組，共6組。在感染后1 h、3 h、5 h、9 h和13 h收獲細(xì)胞：① WB檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Beclin1表達(dá)效率；②Annexin.V-FITC/Propidium Iodide（Ann.V/PI）雙染流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry， FCM）分析細(xì)胞凋亡率；③酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢

8、測(cè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）。
　　結(jié)果：
　　一、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1自噬過(guò)程的影響
　　1. WB檢測(cè)自噬底物蛋白p62結(jié)果顯示，30μM CQ作用THP-1細(xì)胞6 h后， p62已出現(xiàn)明顯累積（p<0.01），40μM CQ作用細(xì)胞6

9、h后，累積程度達(dá)到飽和。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，30μM和40μM CQ作用細(xì)胞24 h后，存活率分別為58.58%和46.03%。
　　2. OD600測(cè)定菌液濃度結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，30μM CQ對(duì)3株受試菌菌量未見(jiàn)明顯影響。參照文獻(xiàn)，30μM CQ作用THP-1細(xì)胞6 h，自噬底物蛋白p62出現(xiàn)明顯累積，作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率超過(guò)50%，且對(duì)細(xì)菌未見(jiàn)明顯影響，因此將30μM作為CQ的后續(xù)工作濃度。
　　3.

10、WB檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和底物蛋白p62結(jié)果顯示，細(xì)菌與細(xì)胞共作用1 h，CQ干預(yù)組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值明顯高于對(duì)照組（p<0.01），其中突變株ST8-ΔpRST98 LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值的增加量均高于野生株ST8及回補(bǔ)株 ST8-c-pRST98（p<0.05）。細(xì)菌與細(xì)胞共作用3 h， CQ干預(yù)組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值較對(duì)照組

11、上升（p<0.05），但突變株ST8-ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST8及回補(bǔ)株ST8-c-pRST98（p<0.01）。
　　4.用mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，CLSM檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)菌與細(xì)胞共作用1 h，CQ干預(yù)組突變株ST8-ΔpRST98感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量高于對(duì)照組，而野生株 ST8和回補(bǔ)株 ST8-c-pRST98感染細(xì)胞中未見(jiàn)顯著差異。細(xì)菌與細(xì)胞共作用3 h，CQ干預(yù)組3株菌感染細(xì)

12、胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量均高于對(duì)照組，其中突變株ST8-ΔpRST98的上升量顯著高于野生株ST8及回補(bǔ)株ST8-c-pRST98（p<0.01）。
　　二、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1凋亡和炎癥反應(yīng)的影響
　　1. FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，Beclin1蛋白過(guò)表達(dá)組，在細(xì)菌與細(xì)胞共作用的1 h、3 h、5 h和9 h，野生株ST8、回補(bǔ)株ST8-c-pRST98及突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細(xì)胞的凋亡率

13、均上升；細(xì)菌與細(xì)胞共作用13 h，野生株、回補(bǔ)株與突變株感染THP-1的凋亡率未見(jiàn)顯著性差異。對(duì)照組在細(xì)菌與細(xì)胞共作用的1 h和3 h，凋亡率未見(jiàn)顯著差異。細(xì)菌與細(xì)胞共作用5 h、9 h和13 h，突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細(xì)胞凋亡率低于野生株ST8和回補(bǔ)株ST8-c-pRST98感染組（p<0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)愈加明顯。
　　2. ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子結(jié)果顯示，細(xì)菌和細(xì)胞共作用1 h、3 h和5 h，Bec

14、lin1過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組突變株感染細(xì)胞的IL-1β及IL-18表達(dá)水平高于野生株和回補(bǔ)株（p<0.05），而突變株感染細(xì)胞的IL-10表達(dá)水平低于野生株和回補(bǔ)株（p<0.05）。但細(xì)菌與細(xì)胞共作用9 h后，野生株、回補(bǔ)株與突變株感染細(xì)胞的 IL-1β、IL-18和IL-10表達(dá)水平未見(jiàn)顯著差異。細(xì)菌和細(xì)胞共作用1 h、3 h和5 h，Beclin1蛋白過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組3株受試菌感染THP-1細(xì)胞的IL-1β及IL-18表達(dá)水平上升，而I

15、L-10表達(dá)水平下降。細(xì)菌與細(xì)胞共作用9 h，3株受試菌感染THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-18和IL-10表達(dá)水平未見(jiàn)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1. CQ干預(yù)前后，比較THP-1細(xì)胞自噬過(guò)程中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白p62、自噬體和自噬溶酶體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pRST98作用在THP-1細(xì)胞自噬過(guò)程的前期，早于溶酶體降解的過(guò)程。
　　2. Beclin1作為自噬標(biāo)志蛋白，過(guò)表達(dá)后可上調(diào)沙門(mén)菌感染