鼠傷寒沙門菌pat-cobB缺失株的構(gòu)建及其應(yīng)對(duì)酸壓力的研究.pdf

1、作為腸道細(xì)菌，鼠傷寒沙門菌(Salmonella spp.)需要克服胃中酸性環(huán)境，才能進(jìn)一步入侵宿主腸道上皮細(xì)胞。已有研究表明，沙門菌已經(jīng)進(jìn)化出多種應(yīng)答機(jī)制，增強(qiáng)自身在酸性環(huán)境下的生存。對(duì)于沙門菌抗酸機(jī)制研究最多的是酸耐受應(yīng)答(Acid toleranceresponse，ATR)。ATR指經(jīng)過(guò)弱酸的適應(yīng)，在隨后的致死酸性條件下細(xì)菌存活能力增強(qiáng)的現(xiàn)象。因而，經(jīng)過(guò)ATR的沙門菌可以更好地抵御胃酸，增加入侵力以及毒力，導(dǎo)致人或其他宿主患病的

2、幾率升高[1]。
　　目前，兩個(gè)pH依賴的ATR已經(jīng)知道，即對(duì)數(shù)期ATR和平臺(tái)期ATR。在這兩個(gè)過(guò)程中都需要誘導(dǎo)合成多種酸激蛋白(Acid shock proteins，ASPs)，保護(hù)和修復(fù)在酸壓力下受到損傷的大分子，這些大分子分別在沙門菌的不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮著作用。同時(shí)沙門菌還具有賴氨酸和精氨酸兩種脫羧系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵將胞內(nèi)的H+泵出體外，從而在強(qiáng)酸下維持胞內(nèi)pH相對(duì)穩(wěn)定。
　　原核生物的乙?；芯恐饕菍?duì)沙門

3、菌的研究。在沙門菌體內(nèi)，cobB負(fù)責(zé)編碼Sir2同源蛋白，行使去乙?；δ?pat編碼乙酰基轉(zhuǎn)移酶(YfiQ)，具有乙?；δ躘2]?；谏抽T菌中大量蛋白存在乙酰化修飾現(xiàn)象，而且乙?；揎梾⑴c細(xì)菌各種生理活動(dòng)，我們推測(cè)乙?；?去乙酰化修飾系統(tǒng)可能參與了鼠傷寒沙門菌的酸耐受應(yīng)答。
　　因此，本研究首先采用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌pat和cobB突變株，通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線比較pat突變株、cobB突變株與野生株Salmo

4、nella entericaserovar Typhimurium14028s生長(zhǎng)差異，利用Cfu計(jì)數(shù)法檢測(cè)三株菌對(duì)酸耐受應(yīng)答和抗酸的差異，Western blot檢測(cè)酸性培養(yǎng)條件和正常培養(yǎng)條件下Salmonella Typhimurium乙?；V的差異，以及三株菌胞內(nèi)pH的變化，最后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在分子水平上檢測(cè)耐酸和抗酸的相關(guān)基因在三株菌中的轉(zhuǎn)錄變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，λ-Red同源重組系統(tǒng)可有效地用于沙門菌的基

5、因敲除。與野生株相比，pat或cobB突變的Salmonella Typhimurium生長(zhǎng)情況無(wú)顯著差異，表明行使乙酰化/去乙?；δ艿膒atcobB的缺失并不會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。通過(guò)將這三株菌放于弱酸條件下適應(yīng)，再放于強(qiáng)酸環(huán)境中，進(jìn)行ATR，該三株菌無(wú)論在對(duì)數(shù)期還是平臺(tái)期，存活率均無(wú)差異，但是生長(zhǎng)到平臺(tái)期的菌對(duì)外界逆境的抵抗能力明顯強(qiáng)于對(duì)數(shù)期的菌。上述結(jié)果說(shuō)明，這對(duì)乙?；?去乙?；窹at/CobB在沙門菌的對(duì)數(shù)期以及平臺(tái)期酸耐受應(yīng)答

6、中均未發(fā)揮重要作用。但是pat的敲除會(huì)導(dǎo)致對(duì)數(shù)期沙門菌在抗酸實(shí)驗(yàn)中存活率上升，cobB的敲除會(huì)導(dǎo)致平臺(tái)期沙門菌在抗酸實(shí)驗(yàn)中存活率下降。Western blot技術(shù)檢測(cè)酸性環(huán)境的刺激并不能顯著改變沙門菌乙?；V，并且三個(gè)菌株在酸環(huán)境中的胞內(nèi)pH幾乎一致。隨后，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在分子水平上檢測(cè)了目前已知的幾個(gè)參與沙門菌耐酸和抗酸基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明phoP在pat的敲除株中轉(zhuǎn)錄上升。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酰