大麻素II型受體激動劑對小鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】：
　　隨著溶栓、PCI介入以及冠狀動脈旁路移植術(shù)等技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，冠心病心肌梗死的死亡率有了明顯的降低，然而由于心肌梗死后心臟調(diào)控機(jī)制失衡引起的心肌間質(zhì)纖維化嚴(yán)重影響了心臟的舒張收縮功能，最終導(dǎo)致心衰，進(jìn)而影響了患者生存率。因此，如何有效降低心室重塑過程中過度纖維化的發(fā)生成了近些年來的熱點(diǎn)問題。
　　目前臨床針缺乏特殊針對心肌纖維化的藥物，主要通過改善心室重塑延緩纖維化的發(fā)生，臨床使用的改善心室重塑的

2、藥物主要有：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類(ACEI)、血管緊張素 II受體拮抗劑類(ARBs)、醛固酮受體拮抗劑、β受體阻滯劑類等，雖有效果，但卻面臨治療途徑單一，治療禁忌癥的限制等問題，因此，急需尋找更多的有效的靶點(diǎn)和藥物減少心梗后心肌纖維化的發(fā)生。
　　大麻素激動劑通過和細(xì)胞表面的大麻素受體(cannabinoid receptor)進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其作用，根據(jù)受體在人體的分布將其分為兩類，即大麻素I型受體CB1和II型受體CB2

3、，CB1和CB2均為七跨膜的G蛋白藕聯(lián)受體。其中CB1受體主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而CB2受體主要分布在外周組織和免疫細(xì)胞。近年來CB2受體的心血管保護(hù)作用得到越來越多的關(guān)注，此外有文獻(xiàn)報(bào)道，CB2受體可以減少肝硬化小鼠肝臟膠原含量，CB2受體可以減少小鼠皮膚纖維化的發(fā)生。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)擬觀察大麻素II型受體選擇性激動劑AM1241對小鼠心肌梗死后纖維化的作用，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在可能的分子機(jī)制。
　　【研究目的】：<

4、br>　　1.在體評價(jià)選擇性 CB2受體激動劑 AM1241對心肌梗死后的小鼠心臟纖維化程度的影響，并觀察其對心功能的影響。
　　2.離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察AM1241對小鼠心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型、分泌功能的作用。
　　3.探討Nrf2、TGFβ1/Smad3在心肌梗死后心肌纖維化中的分子機(jī)制。
　　【研究方法】：
　　1.建立小鼠心肌梗死模型，術(shù)后給予AM1241治療一周，術(shù)后一個(gè)月小動物超聲觀察心功能變化；取心臟組織

5、石蠟包埋，組織天狼猩紅染色，觀察膠原面積；提取心臟組織蛋白，Western Blot檢測纖維化相關(guān)分子指標(biāo)變化。
　　2.分離小鼠心臟成纖維細(xì)胞并鑒定其純度，缺氧饑餓處理，體外模擬心梗環(huán)境，采用不同濃度AM1241處理缺氧饑餓的小鼠成纖維細(xì)胞，觀察AM1241的最適濃度；分別采用免疫熒光染色激光共聚焦觀察和Western Blot方法觀察AM1241對缺氧饑餓的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型、分泌功能的影響。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)，MDA

6、、GSH、SOD試劑盒檢測AM1241對缺氧饑餓處理的成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響；采用Nrf2 siRNA干擾技術(shù)和Western Blot技術(shù)探討Nrf2和TGF-β1/Smad3信號通路在AM1241治療過程中與氧化應(yīng)激之間的機(jī)制關(guān)系。
　　【研究結(jié)果】：
　　1.心臟組織切片天狼猩紅染色，偏振光下觀察發(fā)現(xiàn)“MI+AM1241”組心肌間質(zhì)膠原含量為(11.40±0.66％)明顯低于“MI”組(18.37±1.12%)；We

7、stern blot結(jié)果顯示“MI+AM1241”組心臟組織I型膠原，III型膠原，纖維粘連蛋白，金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的表達(dá)均較“MI”組有了不同程度的降低；M型超聲心動圖結(jié)果顯示左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)分別由“MI”組的(42.87±3.16%)，(21.64±1.03%)提高到“MI+AM1241”組的(60.04±5.93%)，(26.17±1.88%)

8、而左心室舒張末期容積(LVEDV)和左心室收縮末期容積(LVESV)分別由“MI”組的(0.38±0.02 ml)，(0.19±0.01 ml)降低到“MI+AM1241”組的(0.32±0.01 ml)，(0.12±0.01 ml)。
　　2. Western Blot和免疫熒光的結(jié)果均證實(shí)AM1241可以顯著降低缺氧饑餓狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，并且可以抑制其膠原的分泌，但沉默Nrf2后抑制作用明顯減弱。Western Bl

9、ot結(jié)果顯示缺氧饑餓可以輕微提高心肌成纖維細(xì)胞CB2受體表達(dá)，以及Akt的磷酸化，Nrf2的入核，HO-1的表達(dá)，但AM1241處理可以顯著提高 CB2受體和磷酸化Akt表達(dá)，并加速了Nrf2的入核，使用CB2受體選擇性競爭抑制劑阻斷后，AM1241的激活作用明顯降低，證明AM1241激活CB2受體通過活化AKT加速了Nrf2的入核促進(jìn)了Nrf2下游基因的表達(dá)；
　　3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，AM1241可以明顯降低缺氧饑餓狀態(tài)下心

10、肌成纖維細(xì)胞的ROS生成；試劑盒檢測結(jié)果顯示AM1241可以使缺氧饑餓狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞丙二醛(MDA)的含量由(3.42±0.27nmol/mg)蛋白降低到(2.45±0.29nmol/mg)蛋白；同時(shí) AM1241可以使缺氧饑餓狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量分別從(9.62±1.84 nmol/mg)蛋白，(77.85±2.61 U/mg)蛋白提高到(17.96±1.90 U/mg)蛋白和(

11、126.10±4.90U/mg)蛋白；Western Blot結(jié)果顯示，缺氧饑餓可以提高TGF-β1和p-Smad3分子的表達(dá)，而AM1241可以顯著抑制其表達(dá)，但沉默心肌成纖維細(xì)胞Nrf2基因后發(fā)現(xiàn)抑制作用消失。
　　【研究結(jié)論】：
　　1. CB2受體選擇性激動劑AM1241可以減輕小鼠心肌梗死后心肌纖維化并改善心臟收縮舒張功能。
　　2.激動CB2受體可以抑制缺氧饑餓狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型和分泌。