MicroRNA-214對大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響.pdf

1、目的:心血管疾病是導致中老年死亡的常見原因之一，而心力衰竭是心血管疾病導致死亡的主要原因。在最近幾年有關microRNA-214(miR-214)的研究中，顯示出了其在心血管中的重要作用。大量的研究已經展現(xiàn)出在急性心肌梗死中miR-214表達的相對水平是有區(qū)別的。
　　我們已經研究了miR-214在大鼠的急性心肌梗死模型中通過磷酸酶-張力蛋白同源物途徑發(fā)揮調控左室重塑的作用。此次試驗，我們將繼續(xù)深入的研究miR-214在大鼠模型中

2、急性心肌梗死后心臟纖維化的具體作用:通過結扎大鼠心臟左冠狀動脈的前降支制作急性心肌梗死的模型，心腔注射miR-214的前體及抑制劑來調節(jié)miR-214的表達，實時定量PCR驗證表達情況，觀測不同的miR-214表達水平下膠原相關指標的變化情況。
　　方法:
　　一心肌梗死大鼠模型的制備及miR-214的調節(jié)
　　成年大鼠麻醉后，氣管插管接小動物呼吸機輔助呼吸，被皮后逐層開胸，暴露心臟于胸腔外，阻斷心臟血流約6秒，向心腔

3、內緩慢注射藥物后，然后結扎左冠狀動脈前降支。通過下腔靜脈注射依文思藍的方法證實結扎成功:梗死區(qū)的心肌組織是蒼白色的，非梗死區(qū)的心肌則被染成藍色。將80只大鼠隨機分成4組:假手術組（穿過線后未做結扎n=20），對照組（結扎前心腔內注射PBS，n=20），miR-214上調組（結扎并心腔內注射miR-214前體，n=20），miR-214下調組(結扎并心腔內注射miR-214抑制劑，n=20)。于手術后2周和6周取材，觀察比較這兩個時間段各

4、指標的不同變化。二心重體重比和組織學分析
　　大鼠稱重后通過腹腔內注射水合氯醛的方法處死，取下心臟，稱重后放入10％福爾馬林中固定。固定好的樣本石蠟包埋，切成5um的厚度放于載玻片上進行馬松染色。
　　三 PCR和western
　　取1mm*1mm的梗死邊緣區(qū)的小塊組織，放入EP管中，檢測miR-214及mmp1的mRNA的表達及膠原Ⅰ，膠原Ⅲ，mmp1和tgf-β1蛋白的表達。
　　結果:
　　一心重體

5、重比
　　稱量每只大鼠的體重(g)和心臟重量(mg)在取材時，計算得出的在2周和6周各組的心重體重比:對照組和前體組，抑制劑組和前體組具有顯著的統(tǒng)計學差異。且前一組明顯高于后面的一組。這一結果間接表明心肌組織中miR-214的表達上調能夠抑制急性心肌梗死后的心肌纖維化。與此同時，如果miR-214的表達下調則有利于心肌纖維化的發(fā)生。
　　二馬松染色
　　選取心肌梗死后6周的大鼠左心室心肌進行馬松染色。結果顯示:對照組與

6、前體組對比有更多的纖維組織增生，而抑制劑組的膠原增生最明顯。
　　三實時定量PCR
　　通過RT-PCR驗證不同組別之間miR-214的表達水平。在不同的時間段，與前體組相比，對照組miR-214的表達明顯增加。相對于對照組和前體組，抑制劑組表達的miR-214最少。并且各組之間具有明顯的統(tǒng)計學差異。隨著miR-214表達水平的變化，mmp1呈現(xiàn)一個相反的趨勢。對照組與前體組的表達具有明顯差異，而抑制劑組mmp-1的表達顯著

7、高于前體組。
　　四 western
　　Western的結果顯示除了不同的分組中各項指標的不同表達。在miR-214表達水平高的分組（前體組），膠原Ⅰ，膠原Ⅲ，mmp1和tgf-β1的蛋白表達是降低的。在2周和6周時，假手術組、對照組、抑制劑組的表達與前體組相比具有顯著差異。在2周時，膠原Ⅰ/Ⅲ在各組間沒有明顯差異，而6周時差異明顯?？偟膩碚f，在miR-214的表達上調組，促進纖維化的各項指標均高于單純結扎左冠狀動脈前降支