激活cAMP信號(hào)通路抑制CTGF表達(dá)對(duì)小鼠心肌梗死后心肌纖維化調(diào)控的研究.pdf

1、第I部分環(huán)磷酸腺苷抑制CTGF表達(dá)調(diào)控小鼠心肌梗死后心肌纖維化的作用觀察
　　目的：觀察環(huán)磷酸腺苷(cAMP)對(duì)小鼠心肌梗死后結(jié)締組織生長因子（CTGF）的調(diào)控作用以及對(duì)心肌纖維化的影響
　　方法：72只SPF級(jí)C57BL雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（MS組）、心肌梗死組（MI組）及藥物干預(yù)組（MT組），每組各24只。MI組及MT組小鼠呼吸機(jī)輔助開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）建立心肌梗死動(dòng)物疾病模型；MS組小鼠開胸后不結(jié)扎，

2、其余操作同MI組及MT組。術(shù)后1周開始MT組腹腔注射環(huán)磷酸腺苷葡胺（MAC），連續(xù)給藥4周；同時(shí)MS組及MI組注射等量生理鹽水對(duì)照。術(shù)后第5周，各組隨機(jī)抽取10只小鼠行心臟超聲檢測(cè)，測(cè)量心臟形態(tài)指標(biāo)及心功能指標(biāo)；超聲完畢后，立即開胸收獲心臟標(biāo)本，行組織形態(tài)學(xué)HE染色、膠原纖維Masson染色及CTGF免疫組化染色。各組剩余小鼠按照5只、5只、4只隨機(jī)分成3組，收獲心臟標(biāo)本，分離左心室梗死區(qū)及非梗死區(qū)，分別行羥脯氨酸含量測(cè)定、CTGF蛋白

3、表達(dá)western blot檢測(cè)及CTGF mRNA、TGF-β1 mRNA表達(dá)量RT-PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果：超聲心動(dòng)圖提示MT組射血分?jǐn)?shù)（EF）為（19.83±3.95）％，左室短軸縮短率（FS）為（9.07±1.9）%，均高于MI組[EF（13.65±2.14）%，F(xiàn)S（6.22±1.03）%]（P<0.05）；左心室每搏輸出量（SV）MT組[（26.26±3.57）μL]優(yōu)于MI組[（18.82±2.71）μL]（P<0.

4、05）；MT組左心室前、后壁厚度及內(nèi)徑與MI組之間無明顯差異（P>0.05）。心臟Masson染色提示MT組膠原纖維向非梗死區(qū)心肌組織浸潤減少；免疫組化CTGF陽性表達(dá)較MI組減少。MT組梗死區(qū)羥脯氨酸含量[（1388.98±86.26）μg/mg]低于MI組[（1673.12±199.97）μg/mg]（P<0.05）；非梗死區(qū)羥脯氨酸含量[（662.92±98.05）μg/mg]低于MI組[（855.84±83.3）μg/mg）]（

5、P<0.05）。Western blot檢測(cè)提示MT組CTGF蛋白表達(dá)量低于MI組（P<0.05）。RT-PCR檢測(cè)提示MT組CTGF mRNA表達(dá)量低于MI組（P<0.05）；TGF-β1 mRNA表達(dá)量MT組與MI組之間在梗死區(qū)與非梗死區(qū)均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：環(huán)磷酸腺苷可以抑制CTGF的表達(dá)，降低小鼠心肌梗死后膠原纖維的表達(dá)，減輕梗死區(qū)膠原纖維向非梗死區(qū)心肌的浸潤程度，改善心臟功能。
　　第II

6、部分激活cAMP信號(hào)通路調(diào)控小鼠心肌成纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長因子的表達(dá)
　　目的：研究小鼠心肌成纖維細(xì)胞（MCFs）胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度提高對(duì)結(jié)締組織生長因子（CTGF）表達(dá)的影響及其信號(hào)通路。
　　方法：采用1周齡內(nèi)C57BL乳鼠，獲取心臟后分離培養(yǎng)原代MCFs，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。使用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）培養(yǎng)細(xì)胞，快速上調(diào)MCFs對(duì)CTGF的表達(dá)，模擬小鼠心肌梗死后CTGF高表達(dá)情況。使用腺苷酸環(huán)化

7、酶激活劑Forskolin干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞后檢測(cè)MCFs表達(dá)CTGF的變化，同時(shí)檢測(cè)可能的信號(hào)分子蛋白激酶A（PKA）、p44/42絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）及磷酸化p44/42 MAPK表達(dá)的變化。分別給予PD98509及Rp-cAMPS抑制p44/42 MAPK的磷酸化水平及PKA的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞PKA、p44/42 MAPK、磷酸化p44/42 MAPK表達(dá)的變化，并同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)。
　　結(jié)果：TGF-β1可以

8、快速上調(diào)MCFs對(duì)CTGF的表達(dá)。Forskolin干預(yù)培養(yǎng)MCFs后，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度明顯提高、細(xì)胞活力下降；同時(shí)細(xì)胞中CTGF mRNA及蛋白表達(dá)均下降；其可能的信號(hào)分子PKA表達(dá)上升，磷酸化p44/42 MAPK水平表達(dá)下降而p44/42 MAPK總蛋白無明顯改變。MCFs給予PD98509抑制p44/42 MAPK磷酸化水平后，PKA表達(dá)上升，同時(shí)細(xì)胞中CTGF mRNA及蛋白的表達(dá)下調(diào)；給予Rp-cAMP抑制PKA活化后，p