神經(jīng)源性分化因子(NeuroD)對(duì)小鼠放射性腸損傷的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、NeuroD-EGFP融合蛋白的表達(dá)、純化及跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的研究
　　目的：構(gòu)建神經(jīng)源性分化因子NeuroD與綠色熒光蛋白EGFP的融合蛋白，并研究其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
　　方法：構(gòu)建NeuroD-EGFP原核表達(dá)載體，利用宿主大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)重組 NeuroD-EGFP融合蛋白，再利用層析柱純化得到重組 NeuroD-EGFP融合蛋白。利用熒光顯微鏡等觀察NeuroD-EGFP融合蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
　

2、　結(jié)果：成功構(gòu)建了NeuroD-EGFP原核表達(dá)載體，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化融合蛋白，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明得到了NeuroD-EGFP融合蛋白。在IEC-6及RKO細(xì)胞上清中加入NeuroD-EGFP融合蛋白后，觀察發(fā)現(xiàn)NeuroD-EGFP融合蛋白發(fā)出的綠色熒光聚集在細(xì)胞內(nèi)部。對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射NeuroD-EGFP融合蛋白，5小時(shí)后在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)綠色熒光聚集在小鼠腸道上皮細(xì)胞內(nèi)。
　　

3、結(jié)論：成功表達(dá)并純化得到了重組的NeuroD-EGFP融合蛋白，并驗(yàn)證了其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
　　二、NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠放射性腸損傷的治療作用
　　目的：探討NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠放射性腸損傷的治療作用。
　　方法：C57小鼠分兩批次，每批次隨機(jī)分為PBS組、EGFP組、NeuroD-EGFP組，兩批次分別給予8Gy、9Gyγ線全身照射，觀察并記錄小鼠的體重變化及生存情況，繪制生存曲線。取9

4、Gyγ線全身照射三組小鼠的腸組織，制備病理切片，應(yīng)用H&E染色觀察NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)輻射后小鼠腸道病理形態(tài)學(xué)的影響，應(yīng)用TUNEL染色觀察其對(duì)輻射后小鼠腸道隱窩凋亡細(xì)胞數(shù)目的影響，應(yīng)用Ki-67染色觀察其對(duì)小鼠腸道隱窩增殖細(xì)胞數(shù)目的影響，探討NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)輻射后腸道組織的治療作用。
　　結(jié)果：與PBS組及EGFP組相比，NeuroD-EGFP融合蛋白改善了8Gyγ線照射后小鼠的體重并提高了生存率。對(duì)

5、9Gyγ線全身照射后的小鼠腸道組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與PBS組和EGFP組相比，NeuroD-EGFP組小鼠腸道絨毛高度、隱窩深度及隱窩數(shù)目均大于其他兩組（F=49.49，16.72，10.32，P<0.01），同時(shí)腸道隱窩凋亡細(xì)胞數(shù)目較其他兩組少（F=42.39，P<0.01），腸道隱窩 Ki-67（+）細(xì)胞數(shù)目較多（F=33.21，P<0.01）。
　　結(jié)論：NeuroD-EGFP融合蛋白促進(jìn)了輻射后腸道絨毛及隱窩的修復(fù)，減少了輻

6、射引起的腸道隱窩細(xì)胞凋亡并促進(jìn)了其增殖，對(duì)放射性腸損傷具有治療作用。
　　三、NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠放射性腸損傷治療作用的機(jī)制研究
　　目的：探索NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠放射性腸損傷治療作用的機(jī)制。
　　方法：取9Gy照射后12h EGFP和NeuroD-EGFP處理小鼠的腸組織，應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片篩選兩種處理小鼠腸組織的差異表達(dá)基因，應(yīng)用qRT-PCR對(duì)差異表達(dá)基因Enpp7、Mbl2、Sl

7、c13a1和Slc40a1進(jìn)行了驗(yàn)證。通過篩選NeuroD靶向基因，應(yīng)用免疫組化的方法探索NeuroD-EGFP融合蛋白對(duì)輻射后小鼠腸道組織中組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（Timp-1）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：小鼠腸道組織基因芯片表明NeuroD可影響多種基因的表達(dá)及信號(hào)通路。使用 qRT-PCR驗(yàn)證了差異表達(dá)的基因。GO及 KEGG富集分析顯示 NeuroD差異表達(dá)基因參與多個(gè)生物過程和信號(hào)通路。NeuroD可以增加輻射后小鼠腸