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文檔簡介
1、放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部放療后并發(fā)癥,臨床分為初期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化。近年來關于RILI的研究日益受到學者重視,因其發(fā)病機制未完全闡明,目前臨床上仍缺乏特別有效的治療方法。
基于堿性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast growth factor,bFGF)具有血管再生、創(chuàng)傷修復、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)再生等的生物學作用,目前重組bFGF已被
2、廣泛應用于創(chuàng)傷修復、糖尿病潰瘍、脊髓損傷修復、帕金森綜合征及阿茲海默病等臨床治療。文獻報道bFGF可以促進放射性損傷的修復[1][2],也可能對放射性肺損傷有積極促損傷修復的生物學作用[3]。鑒于此,本課題采用人工修飾方法在bFGF肽鏈一端添加一個膠原蛋白結(jié)合域(collagen binding domain,CBD),構(gòu)建重組CBD-bFGF,并對小鼠放射性肺損傷的早期進行干預,旨在探討 CBD-bFGF對小鼠放射性肺損傷的生物學作用
3、。
第一部分 CBD-bFGF在體外的生物學活性及釋放
目的:
比較膠原結(jié)合堿性成纖維細胞生長因子(colla ge n b ind ing do ma in-bas ic F ibrob la st growth factor,CBD-bFGF)和商品化堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在生物學活性、膠原結(jié)合率及緩釋功能的等方面的差異。
方法:
采用CCK-8方法,檢測CBD-bFGF
4、促進人皮膚成纖維細胞(HS-865)的增殖作用,并且和商品化bFGF作對照。將相同濃度的CBD-bFGF溶液和bFGF溶液與大小相近的膠原支架耦合,6小時后將膠原支架從細胞因子溶液中取出,用 BCA試劑盒(總蛋白定量測試盒)檢測溶液中細胞因子的濃度,計算出CBD-bFGF和bFGF與膠原蛋白的結(jié)合效率;在體外不同時間點計算CBD-bFGF和bFGF從膠原里的釋放量,繪制釋放曲線。
結(jié)果:
在體外,CBD-bFGF促進
5、細胞增殖的生物學活性強于bFGF,與膠原支架的結(jié)合率高于bFGF。釋放曲線表明,bF GF的釋放速度高于CBD-bFGF,CBD-bFGF與膠原結(jié)合后具有明顯的緩釋效果。
結(jié)論:
CBD-bFGF可以高效地結(jié)合膠原蛋白,且具有明顯的緩釋功能,可發(fā)揮bFGF的促增殖作用。
第二部分 CBD-bFGF對小鼠放射性肺損傷早期的干預作用及其機制
目的:
探索CBD-bFGF對小鼠放射性肺損傷早期
6、的干預作用,并探討其可能的機制。
方法:
C57BL/6J雌性小鼠隨機分為四組:空白對照組(A組,n=30只),輻射組(B組,n=50只),輻射后第1天給予 CBD-bFGF組(C組,n=60只),輻射后第7天給予CBD-bFGF組(D組,n=60只)。(1)小鼠放射性肺損傷模型的構(gòu)建;A組小鼠作為空白對照,B、C和D三組小鼠全胸接受X線直線加速器輻射,單次,14Gy。(2) CBD-bFGF對放射性肺損傷小鼠的干預
7、:C組小鼠于輻射后第1天、D組小鼠于輻射后第7天,分別氣管內(nèi)滴注CBD-bFGF(2ug/只)。所有小鼠于輻射后1周、2周、4周、8周、12周、16周、20周,觀察并檢測下列指標:①小鼠體重變化;②小鼠外貌變化;③肺組織切片HE和Masso n染色;④免疫組織化學染色法檢測小鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原蛋白(Collagen-I,Col-1)、III型膠原蛋白(Colla
8、gen-3,Col-3)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達。輻射后第20周時,取A、B、C和D四組各2只小鼠進行肺部CT平掃和三維重建。
結(jié)果:
A組小鼠行動自如,呼吸平穩(wěn),飲食飲水正常,全身毛發(fā)光澤鮮亮。B、C、D三組小鼠輻射后第3天開始出現(xiàn)精神萎靡,反應遲鈍,呼吸頻率較前升高,進食進水量稍減少,在第2周時輻射野的毛發(fā)有少量變白;隨著時間延長,小鼠
9、輻射野毛發(fā)逐漸變白脫落,但輻射部位皮膚無明顯潰爛出血。
A組小鼠體重持續(xù)增加。B、C、D三組小鼠在輻射后體重均下降,在8周后體重下降速度放緩并出現(xiàn)體重回升,但在16周時體重又開始下降。輻射后第16周、第20周后,C、D組小鼠較B組小鼠體重下降更明顯(P<0.05)。
肺組織HE、Masson染色顯示,與A組比較,B、C、D組小鼠早期有炎癥細胞浸潤,組織滲出增加,間質(zhì)炎癥改變,間隔增厚;并隨著時間的推移,后期肺組織結(jié)構(gòu)
10、破壞,肺間質(zhì)膠原纖維進展性沉積,肺泡逐漸萎縮甚至消失,肺纖維化形成。C、D兩組與B組比較,給予CBD-bFGF后小鼠肺組織HE、Masson染色提示急性放射性肺炎并未減輕,反而在輻射后第16周、20周小鼠肺組織HE、Masso n染色提示肺纖維化加重(P<0.05)。
小鼠肺組織免疫組化檢測顯示,B、C、D三組與A組比較,小鼠肺組織中,α-SMA、Col-1、Co l-3、TGF-β1表達均顯著增多(P<0.001);第20周
11、時,C、D組小鼠肺組織α-SMA、Co l-1、Col-3、TGF-β1的表達,較B組小鼠要明顯增高(P<0.05);第20周時小鼠肺部CT掃描圖像和三維重建圖像表明,空白組小鼠肺部C T正常,而輻射組和干預組小鼠肺部表現(xiàn)為兩肺彌漫間質(zhì)性改變。
結(jié)論:
C57BL/6J小鼠胸部接受單次14Gy劑量輻射,能成功構(gòu)建放射性肺損傷動物模型。放射性肺損傷小鼠早期給予 CBD-bFGF干預后,并沒有出現(xiàn)加快肺損傷修復效應,反而
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