氯氰菊酯對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用和極化的影響及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、氯氰菊酯屬于Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中害蟲(chóng)的防治。近年來(lái)由于高毒有機(jī)磷和氨基甲酸醋農(nóng)藥的禁用，氯氰菊酯等高效、廣譜及對(duì)哺乳動(dòng)物急性低毒的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的使用范圍不斷擴(kuò)大，用量持續(xù)增加，由此造成的環(huán)境污染急劇加重。對(duì)該類(lèi)農(nóng)藥的生產(chǎn)性和非生產(chǎn)性中毒病例已有報(bào)道，其相關(guān)的毒性機(jī)制研究也逐漸加深。
　　眾所周知，免疫應(yīng)答和免疫功能失衡會(huì)造成多種疾病包括感染、腫瘤和自身免疫性疾病等的發(fā)生。先前研究已有一些關(guān)于

2、氯氰菊酯免疫毒性的報(bào)道，如小鼠染毒氯氰菊酯后，免疫功能晝夜節(jié)律消失，表明免疫系統(tǒng)是氯氰菊酯的靶標(biāo)之一。此外研究結(jié)果還顯示亞致死劑量的氯氰菊酯對(duì)動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫都能產(chǎn)生抑制作用。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要成分之一，在炎癥、防御、修復(fù)、代謝等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也對(duì)機(jī)體維持自身穩(wěn)定非常關(guān)鍵。為了更加清楚的闡明氯氰菊酯的免疫毒性及其機(jī)制，本研究選用了小鼠巨噬細(xì)胞為模型，深入探討氯氰菊酯對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用、極化影響及其

3、相關(guān)分子機(jī)制。
　　1.氯氰菊酯對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制研究
　　首先我們的實(shí)驗(yàn)參考氯氰菊酯防治柑橘害蟲(chóng)的噴霧濃度范圍30～100mg/L，選用0-200μM(相當(dāng)83.2 mg/L)的氯氰菊酯暴露巨噬細(xì)胞。研究顯示，100μM和200μM氯氰菊酯暴露巨噬細(xì)胞48h時(shí)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率相比對(duì)照組顯著下降。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)氯氰菊酯能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系;同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)各氯氰菊酯暴露組細(xì)胞內(nèi)ROS高于對(duì)

4、照組，尤其是200μM暴露組差異顯著。氯氰菊酯暴露還能使細(xì)胞周期阻滯于G1期以及DNA發(fā)生損傷。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)氯氰菊酯引起的細(xì)胞毒性具有明顯的保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為:NAC能顯著增加細(xì)胞活率;NAC能明顯減輕細(xì)胞DNA損傷;NAC能部分抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生;NAC能抑制G1期細(xì)胞周期阻滯。我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯暴露使ERK1/2和JNK信號(hào)通路激活。加入NAC能抑制ERK1/2和JNK的激活。ERK1/2特異性抑制劑PD9

5、8059和JNK特異性抑制劑SP600125可有效抑制氯氰菊酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.氯氰菊酯對(duì)巨噬細(xì)胞極化和功能的影響及相關(guān)機(jī)制
　　巨噬細(xì)胞具有高度可塑性和異質(zhì)性。巨噬細(xì)胞在特定的微環(huán)境以及體內(nèi)外刺激作用下通常可以活化成兩種表型:被IFN-γ和LPS刺激而激活分化成經(jīng)典的M1型，以及替代性活化的M2型。M1型巨噬細(xì)胞能殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞;M2型巨噬細(xì)胞可分泌免疫抑制因子和多種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，具有抑制炎癥

6、反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的功能。
　　這部分的研究是在氯氰菊酯暴露不影響巨噬細(xì)胞活率的前提下進(jìn)行。氯氰菊酯處理巨噬細(xì)胞會(huì)抑制LPS誘導(dǎo)的M1型標(biāo)志基因TNF-α，IL-6和iNOS分泌，表明氯氰菊酯會(huì)抑制M1型巨噬細(xì)胞極化;此外我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯會(huì)使巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志分子Arg-1，F(xiàn)izzl和Mgl2表達(dá)增加，并呈現(xiàn)氯氰菊酯劑量依賴(lài)效應(yīng)，說(shuō)明氯氰菊酯能促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化。氯氰菊酯在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化過(guò)程中，主要

7、是通過(guò)降低miRNA-155的表達(dá)。我們的研究也驗(yàn)證了，如果過(guò)表達(dá)miRNA-155，會(huì)導(dǎo)致氯氰菊酯處理的巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志分子表達(dá)下調(diào);而抑制了miRNA-155，會(huì)引起氯氰菊酯處理的巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯處理細(xì)胞使Bcl6表達(dá)上調(diào)。通過(guò)將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別和miRNA-155 mimics共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，結(jié)果顯示野生型Bcl63'-UTRpMIR-Bcl6熒光素酶報(bào)告基因活性在miR-1

8、55過(guò)表達(dá)細(xì)胞中明顯降低，而突變型Bcl63'-UTR pMIR-Bcl6-mut熒光素酶報(bào)告基因活性在miR-155過(guò)表達(dá)細(xì)胞中無(wú)明顯變化，這些結(jié)果說(shuō)明miR-155能夠靶向結(jié)合Bcl63'-UTR區(qū)沉默Bcl6的表達(dá)。因此氯氰菊酯能夠通過(guò)降低miR-155的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了miR-155對(duì)Bcl6的抑制作用，使Bcl6表達(dá)上調(diào)。當(dāng)巨噬細(xì)胞沉默Bcl6的表達(dá)時(shí)，氯氰菊酯處理的巨噬細(xì)胞M2型相關(guān)基因Arg-1，F(xiàn)izzl和Mgl2表達(dá)下調(diào)，

9、相反，當(dāng)巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bcl6時(shí)，M2型相關(guān)的基因Arg-1和Mgl2表達(dá)上調(diào)，這部分的結(jié)果說(shuō)明Bcl6在氯氰菊酯介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞由M1向M2極化中起著重要的作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)Bcl6可抑制MKK4的表達(dá)。當(dāng)過(guò)表達(dá)Bcl6時(shí)，MKK4的表達(dá)被抑制，而MKK4是直接激活JNK的激酶，即JNK活化也受到抑制;如果將Bcl6敲除，MKK4表達(dá)明顯升高，促進(jìn)其下游的JNK磷酸化而激活。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-155前提下，同時(shí)敲除巨噬細(xì)胞MKK

10、4的表達(dá)或者用JNK的抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，與沒(méi)有敲除MKK4或者沒(méi)有加JNK抑制劑相比，氯氰菊酯誘導(dǎo)的M2型標(biāo)志基因表達(dá)上調(diào)，使M1型基因表達(dá)下調(diào)。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor時(shí)，同時(shí)敲除Bcl6的表達(dá)，與沒(méi)有敲除Bcl6相比，氯氰菊酯誘導(dǎo)的M2型相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，M1型相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。上述研究結(jié)果表明，氯氰菊酯可通過(guò)miRNA-155/Bcl6/MKK4/JNK通路調(diào)控巨噬細(xì)胞由M1向M2極化。體外遷移和體內(nèi)成瘤實(shí)

11、驗(yàn)驗(yàn)證了氯氰菊酯對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，氯氰菊酯所誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞相比LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞，能顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)。
　　綜合以上研究結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論:
　　(1)氯氰菊酯長(zhǎng)時(shí)間(48h)暴露可以劑量依賴(lài)性的抑制巨噬細(xì)胞活率;氯氰菊酯可以誘導(dǎo)ROS生成，NAC預(yù)處理能降低DNA損傷、抑制G1期細(xì)胞周期阻滯以及凋亡的發(fā)生。氯氰菊酯可以激活JNK和ERK1/2通路，并通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)JNK和ERK1/2