氯氰菊酯對巨噬細胞的毒性作用和極化的影響及其相關機制.pdf

1、氯氰菊酯屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，被廣泛應用于農業(yè)生產及日常生活中害蟲的防治。近年來由于高毒有機磷和氨基甲酸醋農藥的禁用，氯氰菊酯等高效、廣譜及對哺乳動物急性低毒的擬除蟲菊酯類農藥的使用范圍不斷擴大，用量持續(xù)增加，由此造成的環(huán)境污染急劇加重。對該類農藥的生產性和非生產性中毒病例已有報道，其相關的毒性機制研究也逐漸加深。
　　眾所周知，免疫應答和免疫功能失衡會造成多種疾病包括感染、腫瘤和自身免疫性疾病等的發(fā)生。先前研究已有一些關于

2、氯氰菊酯免疫毒性的報道，如小鼠染毒氯氰菊酯后，免疫功能晝夜節(jié)律消失，表明免疫系統(tǒng)是氯氰菊酯的靶標之一。此外研究結果還顯示亞致死劑量的氯氰菊酯對動物的體液免疫和細胞免疫都能產生抑制作用。巨噬細胞作為機體固有免疫系統(tǒng)的重要成分之一，在炎癥、防御、修復、代謝等生理過程中發(fā)揮重要作用，同時也對機體維持自身穩(wěn)定非常關鍵。為了更加清楚的闡明氯氰菊酯的免疫毒性及其機制，本研究選用了小鼠巨噬細胞為模型，深入探討氯氰菊酯對巨噬細胞的毒性作用、極化影響及其

3、相關分子機制。
　　1.氯氰菊酯對巨噬細胞的毒性作用及機制研究
　　首先我們的實驗參考氯氰菊酯防治柑橘害蟲的噴霧濃度范圍30～100mg/L，選用0-200μM(相當83.2 mg/L)的氯氰菊酯暴露巨噬細胞。研究顯示，100μM和200μM氯氰菊酯暴露巨噬細胞48h時，MTT法檢測細胞活率相比對照組顯著下降。用流式細胞儀檢測氯氰菊酯能夠誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡，且呈劑量效應關系;同時我們還發(fā)現(xiàn)各氯氰菊酯暴露組細胞內ROS高于對

4、照組，尤其是200μM暴露組差異顯著。氯氰菊酯暴露還能使細胞周期阻滯于G1期以及DNA發(fā)生損傷。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對氯氰菊酯引起的細胞毒性具有明顯的保護作用，主要表現(xiàn)為:NAC能顯著增加細胞活率;NAC能明顯減輕細胞DNA損傷;NAC能部分抑制細胞凋亡的發(fā)生;NAC能抑制G1期細胞周期阻滯。我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯暴露使ERK1/2和JNK信號通路激活。加入NAC能抑制ERK1/2和JNK的激活。ERK1/2特異性抑制劑PD9

5、8059和JNK特異性抑制劑SP600125可有效抑制氯氰菊酯誘導的細胞凋亡。
　　2.氯氰菊酯對巨噬細胞極化和功能的影響及相關機制
　　巨噬細胞具有高度可塑性和異質性。巨噬細胞在特定的微環(huán)境以及體內外刺激作用下通常可以活化成兩種表型:被IFN-γ和LPS刺激而激活分化成經典的M1型，以及替代性活化的M2型。M1型巨噬細胞能殺滅細胞內病原體和腫瘤細胞;M2型巨噬細胞可分泌免疫抑制因子和多種促進腫瘤生長的細胞因子，具有抑制炎癥

6、反應和促進腫瘤細胞生長與轉移的功能。
　　這部分的研究是在氯氰菊酯暴露不影響巨噬細胞活率的前提下進行。氯氰菊酯處理巨噬細胞會抑制LPS誘導的M1型標志基因TNF-α，IL-6和iNOS分泌，表明氯氰菊酯會抑制M1型巨噬細胞極化;此外我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯會使巨噬細胞M2型標志分子Arg-1，F(xiàn)izzl和Mgl2表達增加，并呈現(xiàn)氯氰菊酯劑量依賴效應，說明氯氰菊酯能促進M1型巨噬細胞向M2型極化。氯氰菊酯在誘導巨噬細胞M2極化過程中，主要

7、是通過降低miRNA-155的表達。我們的研究也驗證了，如果過表達miRNA-155，會導致氯氰菊酯處理的巨噬細胞M2型標志分子表達下調;而抑制了miRNA-155，會引起氯氰菊酯處理的巨噬細胞M2型標志分子表達上調。同時我們還發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯處理細胞使Bcl6表達上調。通過將熒光素酶報告基因質粒，分別和miRNA-155 mimics共轉染至293T細胞，結果顯示野生型Bcl63'-UTRpMIR-Bcl6熒光素酶報告基因活性在miR-1

8、55過表達細胞中明顯降低，而突變型Bcl63'-UTR pMIR-Bcl6-mut熒光素酶報告基因活性在miR-155過表達細胞中無明顯變化，這些結果說明miR-155能夠靶向結合Bcl63'-UTR區(qū)沉默Bcl6的表達。因此氯氰菊酯能夠通過降低miR-155的表達，逆轉了miR-155對Bcl6的抑制作用，使Bcl6表達上調。當巨噬細胞沉默Bcl6的表達時，氯氰菊酯處理的巨噬細胞M2型相關基因Arg-1，F(xiàn)izzl和Mgl2表達下調，

9、相反，當巨噬細胞過表達Bcl6時，M2型相關的基因Arg-1和Mgl2表達上調，這部分的結果說明Bcl6在氯氰菊酯介導的巨噬細胞由M1向M2極化中起著重要的作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)Bcl6可抑制MKK4的表達。當過表達Bcl6時，MKK4的表達被抑制，而MKK4是直接激活JNK的激酶，即JNK活化也受到抑制;如果將Bcl6敲除，MKK4表達明顯升高，促進其下游的JNK磷酸化而激活。在細胞轉染miRNA-155前提下，同時敲除巨噬細胞MKK

10、4的表達或者用JNK的抑制劑處理細胞時，與沒有敲除MKK4或者沒有加JNK抑制劑相比，氯氰菊酯誘導的M2型標志基因表達上調，使M1型基因表達下調。當細胞轉染miRNA-155 inhibitor時，同時敲除Bcl6的表達，與沒有敲除Bcl6相比，氯氰菊酯誘導的M2型相關基因表達下調，M1型相關基因表達上調。上述研究結果表明，氯氰菊酯可通過miRNA-155/Bcl6/MKK4/JNK通路調控巨噬細胞由M1向M2極化。體外遷移和體內成瘤實

11、驗驗證了氯氰菊酯對巨噬細胞功能的影響，氯氰菊酯所誘導的M2型巨噬細胞相比LPS誘導的M1型巨噬細胞，能顯著促進肺癌細胞的遷移和生長。
　　綜合以上研究結果，我們可以得出以下結論:
　　(1)氯氰菊酯長時間(48h)暴露可以劑量依賴性的抑制巨噬細胞活率;氯氰菊酯可以誘導ROS生成，NAC預處理能降低DNA損傷、抑制G1期細胞周期阻滯以及凋亡的發(fā)生。氯氰菊酯可以激活JNK和ERK1/2通路，并通過氧化應激誘導JNK和ERK1/2