組氨酸激酶DRK1在申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換及致病性形成中的作用及黃芪抗小鼠孢子絲菌感染機(jī)制的初探.pdf

1、在人類生存的環(huán)境中存在超過100，000種不同類型的真菌，其中雙相性致病真菌有:皮炎芽生菌、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、馬爾尼非青霉菌和申克孢子絲菌。雙相真菌的孢子入侵宿主體內(nèi)后其形態(tài)便會由體外環(huán)境中非致病的菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換為體內(nèi)環(huán)境中致病的酵母形態(tài)。與其他5種雙相真菌相比，孢子絲菌病的發(fā)病率最高，可引起皮膚、皮下組織以及附近淋巴管的慢性感染，導(dǎo)致化膿、潰爛及滲出，偶可累及肌肉、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等臟器。孢子絲菌病的病原體為

2、申克孢子絲菌，具有雙相性:25℃為菌絲相，呈灰白至棕褐色霉菌樣菌落生長，鏡下為細(xì)長的分隔菌絲、未分化的菌絲形成的產(chǎn)孢細(xì)胞及由其產(chǎn)生的小的，簇集分布的分生孢子組成。菌絲相的分生孢子不會出芽形成酵母細(xì)胞，不具致病性;37℃為酵母相，呈奶油或棕褐色酵母樣菌落生長，鏡下為圓的或卵圓形酵母樣細(xì)胞，窄的基底上可發(fā)出細(xì)長雪茄樣的芽，與感染組織病理切片中的菌體形態(tài)一致，具有致病性。孢子絲菌由菌絲相轉(zhuǎn)化為酵母相的過程被認(rèn)為是孢子絲菌致病性形成的過程，對孢

3、子絲菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過程的深入研究有助于揭示孢子絲菌病的發(fā)病機(jī)制。雙相真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化是一個多因素共同參與的復(fù)雜過程，是真菌通過其信號傳導(dǎo)系統(tǒng)感受并將變化了的環(huán)境信號因子級聯(lián)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，引起特定的基因表達(dá)進(jìn)而行使功能的過程。既往的研究中本課題組曾應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法比較了孢子絲菌菌絲相及酵母相的蛋白表達(dá)圖譜，鑒定了24個酵母相特異或上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中包括雙組份信號系統(tǒng)組氨酸激酶DRK1基因，為了進(jìn)一步探討DRK1在孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)化

4、和致病性形成中的作用，我們進(jìn)行了本文的研究。
　　 目的:
　　 1，克隆孢子絲菌組氨酸激酶DRK1的基因。
　　 2，構(gòu)建一種由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的適于多種絲狀真菌基因研究用的RNA干擾載體。
　　 3，研究DRK1基因在孢子絲菌菌絲及酵母細(xì)胞生長、菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)化、細(xì)胞壁組成、下游基因表達(dá)以及孢子絲菌致病性形成等方面的影響。
　　 4，明確中藥黃芪在調(diào)節(jié)宿主免疫狀態(tài)及孢子絲菌病輔助治療中的潛在功

5、效。
　　 方法:
　　 1、通過RACE技術(shù)獲得組氨酸激酶DRK1的cDNA全長，克隆DRK1的基因組全長，對二者進(jìn)行比對找出內(nèi)含子，鑒定DRK1基因的功能結(jié)構(gòu)域。
　　 2、依次構(gòu)建中間載體PCB301、PCB309、PUC-PUT、PUC-PDUDT，導(dǎo)入真菌通用啟動子PtrpC、終止子TtrpC、發(fā)夾結(jié)構(gòu)gus基因、潮霉素抗性基因Hypr、DRK1正反向干擾序列，最終構(gòu)建干擾載體PCB309-PDUDT。

6、優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化宿主的反應(yīng)體系，分別確定誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)劑的種類和濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間以及篩選培養(yǎng)基最佳的潮霉素濃度等參數(shù)。
　　 3、通過比較野生標(biāo)準(zhǔn)株，空轉(zhuǎn)株（轉(zhuǎn)化空載體PCB309）及DRK1基因干擾株在菌落生長速度、菌落形態(tài)、光鏡電鏡結(jié)構(gòu)、剛果紅敏感性、Zymolyase敏感性、下游基因Ste20/cAMP表達(dá)水平、小鼠感染模型局部皮損炎癥細(xì)胞浸潤情況等諸方面的差異，明確DRK1基因在孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)化和致病性形成中的作用。

7、r>　　 4、通過比較黃芪給藥組及非給藥組孢子絲菌小鼠感染模型局部皮損炎癥細(xì)胞浸潤程度的差異，明確黃芪在調(diào)節(jié)宿主免疫狀態(tài)及孢子絲菌病輔助治療中的潛在功效。
　　 結(jié)果:
　　 1、完整的申克孢子絲菌DRK1cDNA全長為4743bp，開放閱讀框?yàn)?071bp，編碼1356個氨基酸序列，分子量為147.3kDa，等電點(diǎn)為5.46。與皮炎芽生菌DRK1基因的相似度為65％。孢子絲菌DRK1功能域的分析結(jié)果證實(shí)其由信號感受區(qū)

8、，連接區(qū)及功能區(qū)三部分組成，是一種可溶性組氨酸蛋白激酶，未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。
　　 2、成功的構(gòu)建了長為8825bp的干擾載體PCB309-PDUDT。優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系:誘導(dǎo)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度為200μ mol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為25℃避光培養(yǎng)48h，篩選培養(yǎng)基中潮霉素濃度為100mg/L。應(yīng)用上述載體及轉(zhuǎn)化體系成功的實(shí)現(xiàn)了對孢子絲菌組氨酸激酶DRK1基因的干擾，干擾后其基因表達(dá)水平下調(diào)89％。
　　 3、DR

9、K1基因表達(dá)水平下調(diào)后孢子絲菌的菌落生長延緩，直徑由1.1cm降至0.6cm;黑色素產(chǎn)生減少，干擾株的混懸液顏色明顯變淡;菌絲生長受抑制，培養(yǎng)96H后菌絲干重由2.9689g降至0.9274g;孢子生成減少，培養(yǎng)1W后孢子混懸液分光光度值由1.15降至0.55;菌絲及孢子的細(xì)胞壁變粗糙、疏松;細(xì)胞壁的組成成分發(fā)生變化，對剛果紅及Zymolase的敏感性增加;下游傳導(dǎo)通路基因Ste20、cAMP表達(dá)水平明顯下調(diào)，分別下調(diào)了83％和73％;

10、菌株的毒力降低，所致皮損處的炎癥反應(yīng)輕微，野生標(biāo)準(zhǔn)株及干擾株感染小鼠局部皮損浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)分別為97.5±10和29.4±5，單核細(xì)胞分別為90.2±8和30.0±4，均具有顯著性差異。
　　 4、中藥黃芪可調(diào)節(jié)小鼠宿主的免疫機(jī)能，減輕孢子絲菌感染小鼠的炎癥反應(yīng)，用藥前后局部皮損浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)分別為97.5±10和75.7±2，單核細(xì)胞分別為90.2±8和72.0±2，均具有顯著性差異。
　　 結(jié)論: