核苷二磷酸激酶調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌毒力及致病性的機(jī)制研究.pdf

1、銅綠假單胞菌（PA）又稱綠膿桿菌，是引起燒創(chuàng)傷、免疫功能低下及肺纖維化等病人菌血癥、尿道炎或肺炎等醫(yī)院內(nèi)獲得性感染最常見的條件性致病菌之一。PA具有目前已知的最大細(xì)菌基因組（6.3 Mbp），其開放閱讀框（ORF）多達(dá)5,570個(gè)。目前，已鑒定或預(yù)測具有功能的ORFs僅占總ORFs的54.2％，其中包括參與蛋白分泌系統(tǒng)、二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、外膜蛋白形成、物質(zhì)代謝/轉(zhuǎn)運(yùn)、抗生素抵抗及細(xì)菌表面分子形成等多種功能的ORFs。PA龐大而復(fù)雜的基因組

2、結(jié)構(gòu)，為其適應(yīng)嚴(yán)苛的宿主環(huán)境并引發(fā)感染奠定了重要的分子基礎(chǔ)。在PA眾多ORFs中，與蛋白分泌相關(guān)ORFs在調(diào)節(jié)PA毒力及致病性中起到關(guān)鍵作用。PA具有五大蛋白分泌系統(tǒng)：I-III型和V-VI型。I型蛋白分泌系統(tǒng)（T1SS）和II型蛋白分泌系統(tǒng)（T2SS）可將蛋白直接分泌至細(xì)菌胞外。其中由T1SS或T2SS分泌的堿性蛋白酶、彈性蛋白酶（LasB、LasA）、磷脂酶C、堿性磷酸酶可促進(jìn)組織損傷；由T2SS分泌的脂酶可促進(jìn)脂肪水解。III型蛋

3、白分泌系統(tǒng)（T3SS）負(fù)責(zé)將具有生物學(xué)活性的效應(yīng)蛋白ExoS、ExoT（均具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和Rho GTPase激活蛋白活性）、ExoY（腺苷酸環(huán)化酶活性）和/或 ExoU（磷脂酶活性）注射入宿主細(xì)胞，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡、增殖、吞噬和炎癥等一系列功能；而T5SS和T6SS則通過分泌酯酶、血細(xì)胞凝激素和磷脂酶D等毒力蛋白/因子促進(jìn)對組織的損傷及紅細(xì)胞凝集。此外，PA可通過促進(jìn)綠膿素、綠色熒光素（載鐵體）、藻酸鹽等物質(zhì)合成、調(diào)節(jié)細(xì)

4、菌運(yùn)動（如：集群運(yùn)動）及促進(jìn)生物膜形成等方式促進(jìn)PA對宿主的致病性。目前，調(diào)節(jié)PA毒力及致病性相關(guān)機(jī)制已有諸多報(bào)道，但由于這些機(jī)制的復(fù)雜性和調(diào)節(jié)方式的多樣性，對其深入的研究仍具有重大創(chuàng)新性和挑戰(zhàn)性。
　　核苷二磷酸激酶（Ndk）是調(diào)節(jié)原核和真核生物核酸代謝的重要激酶。盡管Ndk對促進(jìn)PA藻酸鹽的合成及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的吞噬、炎癥應(yīng)答等作用已有報(bào)道，但其對 PA毒力及致病性的系統(tǒng)性影響及相應(yīng)機(jī)制仍不清楚。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PA急

5、性肺感染小鼠模型中，ndk基因表達(dá)水平顯著降低并伴隨著T3SS基因表達(dá)的上調(diào)，提示Ndk是PA急性期感染中的一種重要宿主應(yīng)答蛋白，可能通過自身表達(dá)水平的改變，調(diào)控 PA毒力及對宿主的致病性。因此，本文通過構(gòu)建ndk基因敲除菌株及回補(bǔ)菌株，分別在小鼠肺部感染模型和細(xì)胞感染模型中，考察Ndk在調(diào)節(jié)PA宿主致病性及細(xì)胞毒性中的作用及可能機(jī)制。此外，通過轉(zhuǎn)錄組測序，考察ndk基因敲除對PA全基因組基因表達(dá)的影響；采用RT-qPCR、Wester

6、n blot等方法及相應(yīng)表型鑒定，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，并進(jìn)一步探討Ndk在調(diào)節(jié)PA群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)、胞外毒力因子產(chǎn)生及T3SS中的作用及可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　Ndk在調(diào)節(jié)PA對宿主致病性中的作用。采用Red重組酶系統(tǒng)構(gòu)建PAO1和各PAO1基因突變菌株，并將其滴鼻感染小鼠構(gòu)建小鼠肺感染模型，動態(tài)檢測小鼠死亡率、肺組織水腫、病變及炎癥等情況；將PAO1和各PAO1基因突變菌株感染A549細(xì)胞株，通過CC

7、K8、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等方法，檢測細(xì)胞的活性、凋亡、膜通透性及 T3SS效應(yīng)蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果顯示，小鼠急性期肺部感染時(shí)，ndk基因敲除通過上調(diào)T3SS相關(guān)蛋白表達(dá)水平，加重了由T3SS介導(dǎo)的小鼠肺組織損傷、炎癥應(yīng)答，并增加了小鼠死亡率；ndk基因敲除通過上調(diào)T3SS相關(guān)蛋白表達(dá)水平或增加T3SS效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)了PA對細(xì)胞的毒性、誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡或增加了細(xì)胞膜通透性。
　　Ndk對PA全基

8、因組基因表達(dá)的影響。通過轉(zhuǎn)錄組測序檢測了PAO1及△ndk菌株基因表達(dá)差異。通過GO（gene ontology）功能注釋和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析等生物信息學(xué)方法，考察Ndk對PA全基因組基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，ndk基因敲除影響了 PA物質(zhì)代謝/轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)生命活動相關(guān)基因表達(dá)。此外，ndk基因敲除影響了T3SS、胞外毒力因子合成等細(xì)菌毒力相關(guān)的基因表達(dá)。

9、
　　Ndk對PA毒力相關(guān)表型的影響。采用RT-qPCR、Western blot方法及相應(yīng)表型鑒定，檢測了 PAO1、△ndk和△ndk+（ndk基因回補(bǔ)株）胞外毒力因子和 T3SS相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)情況、運(yùn)動及生物膜形成能力。結(jié)果顯示，ndk基因敲除抑制了胞外毒力因子如：彈性蛋白酶、堿性磷酸酶、吩嗪等相關(guān)基因表達(dá)水平及彈性蛋白酶、綠膿素合成。然而，ndk基因敲除上調(diào)了T3SS基因及蛋白的表達(dá)水平。此外，ndk基因敲除抑制了P

10、A集群運(yùn)動及生物膜形成能力。
　　Ndk對PA QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。采用RT-qPCR、信號分子報(bào)告菌株平板法及高效液相色譜方法，檢測PAO1、△ndk和△ndk+菌株三大QS系統(tǒng)（las、rhl及pqs系統(tǒng)）信號分子合成酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的基因表達(dá)水平及信號分子產(chǎn)量。結(jié)果顯示，ndk基因敲除抑制了QS系統(tǒng)信號分子合成酶基因（lasI、rhlI和pqsA）和轉(zhuǎn)錄因子基因（lasR、rhlR和pqsR）的基因表達(dá)及信號分子（3-o