顆粒細胞線粒體移植對牛孤雌胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、線粒體是真核細胞內重要的半自主性細胞器，通過氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(ATP)，為細胞的各種生理活動提供能量。線粒體大量增殖發(fā)生于囊胚孵出階段，前期胚胎所有的耗能活動主要依靠卵母細胞內數(shù)量有限的線粒體，胚胎附植前任何影響線粒體功能的不良因素都會直接關系到胚胎的正常發(fā)育。受精前卵母細胞中線粒體應有一定的數(shù)量才能保證有足夠數(shù)量的線粒體受精后被分配到每個卵裂球中，并且每個卵裂球中有足夠數(shù)量的線粒體DNA(mtDNA)，以滿足附植早期胚胎mtD

2、NA的復制。胚胎發(fā)育需要一定的ATP，如果卵母細胞內的ATP低于一定的閥值，影響其生理功能，使卵母細胞不能正常發(fā)育?，F(xiàn)已有線粒體轉移改善人受精卵發(fā)育的報道，但未見有線粒體轉移對孤雌激活胚胎發(fā)育影響的報道。本文對牛卵丘顆粒細胞體外培養(yǎng)、牛顆粒細胞線粒體提取和鑒定及線粒體轉移對牛孤雌激活胚胎發(fā)育的影響三個方面進行了研究探討。目的在于提高孤雌激活胚胎的發(fā)育，促進由孤雌激活胚胎或其他類型胚胎分離胚胎干細胞的工作。 1、牛卵丘顆粒細胞用高

3、糖DMEM+10％(V/V)NBS，在38℃、5％CO2、飽和濕度進行培養(yǎng)時，剛貼壁未形成緊密接觸時，細胞形態(tài)為星狀，胞體多為三角形、極少為梭形。2d后顆粒細胞基本匯合形成單層，形態(tài)為多角形，呈鋪路石樣，細胞間界限不清。體外培養(yǎng)的顆粒細胞增殖能力隨傳代次數(shù)增加而下降，到第1、3、6代顆粒細胞凋亡率分別為11.45％，16.63％和39.23％。 2、采用RSB低滲液使顆粒細胞膨脹8min，勻漿破碎細胞，加入高滲液2.5×MS使溶

4、液等滲，經(jīng)差速離心提取牛卵丘顆粒細胞線粒體。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，線粒體外膜和內部嵴完整；用活線粒體特異性的熒光探針MitoTrackerGreenFM(100nM)標記提取的線粒體，用LEICA熒光顯微鏡觀察，線粒體發(fā)出很強的綠色熒光。表明提取的線粒體活性良好。線粒體在高糖DMEM+10％(V/V)NBS中，4℃條件下保存，在LEICA熒光顯微鏡下，10h時已檢測不到有活性的線粒體存在。本實驗向牛卵母細胞內轉移的線粒體體外保存時間小于

5、1h，以保證轉移活線粒體的數(shù)量。 3、在LEICA顯微操作儀下，用自制的內徑10μm的注射針，將一個牛卵母細胞直徑長度的線粒體懸液注射到卵胞質中，每個卵母細胞轉移的線粒體數(shù)量為3000個左右。轉移的懸液體積只占一個牛卵母細胞體積的0.52％，受體牛卵母細胞體積變化很小。對照組卵母細胞分為兩組：一組轉移胚胎培養(yǎng)液，另一組正常激活。各組卵母細胞在5μM離子酶素(Ionomycin)的胚胎培養(yǎng)液中5min。再轉移到含2mM/L6-DM

6、AP+5μg/mL細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液中，激活培養(yǎng)4h，用胚胎培養(yǎng)液洗滌3次后，和單層顆粒細胞共培養(yǎng)，每48h半量換液1次。實驗結果：①激活率：線粒體轉移和胚胎培養(yǎng)液轉移的卵母細胞差異不明顯，但都明顯低于正常的未經(jīng)注射正常激活的卵母細胞(p＜0.05)②卵裂率：線粒體轉移的卵母細胞和正常激活的卵母細胞差異不明顯(p＞0.05)，但都明顯高于轉移胚胎培養(yǎng)液的卵母細胞(p＜0.05)③桑椹胚率：線粒體轉移的卵母細胞明顯高于胚胎培養(yǎng)液轉移