抑制nNOS蛋白表達(dá)對(duì)發(fā)育期小腦顆粒細(xì)胞的影響.pdf

1、一氧化氮(NO)是一種兼有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用的氣體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，NO對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有雙重作用。生理情況下，少量NO可發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，病理情況下，大量的一氧化氮合酶(NOS)尤其是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)激活乍成過量的NO，對(duì)神經(jīng)元及其組織產(chǎn)生巨大的神經(jīng)毒性作用。NO結(jié)構(gòu)簡單又極不穩(wěn)定，生物半衰期僅5秒左右，因此其直接測(cè)定較為困難。體內(nèi)NO主要在NOS專一催化下合成，在研究中我們可通過測(cè)檢NOS的量來間接反

2、映NO的量，從而達(dá)到研究NO作用的目的。NOS是體內(nèi)專一催化合成NO的酶，根據(jù)組織或細(xì)胞來源將NOS分為三型：神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。生理狀況下nNOS和eNOS表達(dá)，iNOS不表達(dá)，其中以nNOS分布最廣泛，主要位于中樞神經(jīng)元，尤其小腦顆粒細(xì)胞層和分子層。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中nNOS催化產(chǎn)生的NO主要調(diào)節(jié)發(fā)育期神經(jīng)元的突觸可塑性、信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)。多數(shù)報(bào)道認(rèn)為腦損傷早期nNOS激活并釋放過

3、量的NO與神經(jīng)毒性作用有關(guān)，但是亦有報(bào)道認(rèn)為NO/nNOS具有神經(jīng)保護(hù)作用，大鼠局灶性腦缺血再灌注24小時(shí)后，位于梗死灶中心區(qū)的nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量越多，梗死灶體積越小。大鼠腦部NOS的分布以小腦最多，尤其nNOS大量分布于顆粒細(xì)胞層和分子層。由于小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)是小腦中數(shù)量最多的細(xì)胞，體外培養(yǎng)方法成熟，易于在體外培養(yǎng)中獲得高純度(>95％)的神經(jīng)元細(xì)胞。此外，體外培養(yǎng)的發(fā)育期的CGNs的基因轉(zhuǎn)染效率高于體內(nèi)成熟的CGNs

4、的基因轉(zhuǎn)染效率。因此，本課題建立小腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元體外培養(yǎng)，使用反義寡核苷酸(AS-ODN)技術(shù)抑制nNOS的水平，并觀察nNOS被抑制后小腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元發(fā)育和存活的變化，從而明確nNOS在神經(jīng)元發(fā)育和存活中的作用。
　　 研究目的:
　　 通過反義寡核苷酸技術(shù)抑制發(fā)育期CGNs中的nNOS，探討nNOS在發(fā)育期小腦顆粒細(xì)胞中的作用和地位，了解nNOS在神經(jīng)元生長中所起的作用，為進(jìn)一步研究NO/nNOS在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中

5、的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.原代CGNs培養(yǎng)：
　　 將出生后7天的SD乳鼠的小腦分離并獲得小腦顆粒細(xì)胞，種植于已用多聚賴氨酸包被過夜的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)于含10％小牛血清、100μg/ml慶大霉素、25mmol/L氯化鉀的細(xì)胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后加入阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元的生長。
　　 2.nNOS AS-ODN設(shè)計(jì)合成：
　　 設(shè)計(jì)合成nNOS AS-ODN序列，使用

6、隨機(jī)序列(R-ODN)作為對(duì)照。由Biognostik(GmbH，Goettingen，Germany)公司合成。
　　 3.寡核苷酸(ODN)的細(xì)胞毒性測(cè)定：
　　 將不同濃度R-ODN加入培養(yǎng)第7天的小腦顆粒細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　 4.AS-ODN有效轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間測(cè)定：
　　 分別將終濃度為不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的最高濃度的nNOS AS-ODN和R-ODN加入培養(yǎng)第7天的CGNs中，使用We

7、stern blot檢測(cè)小腦顆粒細(xì)胞中的nNOS蛋白表達(dá)，使用相同濃度的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的R-ODN(FITC-R-ODN)在倒置熒光顯微鏡下觀察ODN進(jìn)入細(xì)胞的情況，測(cè)定獲得ODN最高轉(zhuǎn)染效率的最佳濃度和時(shí)間。
　　 5.AS-ODN對(duì)發(fā)育期CGNs的影響：
　　 RT-PCR檢測(cè)nNOS的mRNA水平，Western blot和細(xì)胞免疫組化測(cè)定nNOS蛋白水平的變化，并從細(xì)胞免疫組化的結(jié)果分析發(fā)育中小腦顆粒細(xì)胞nN

8、OS的表達(dá)。使用MTT法檢測(cè)nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率變化，使用中性紅染色和顯微鏡下觀察計(jì)算小腦顆粒細(xì)胞存活數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析及Bonferroni多重比較檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0完成，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.nNOS在發(fā)育期CGNs的表達(dá)
　　 體外培養(yǎng)成

9、功獲得純化的原代小腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元，使用免疫組化方法在CGNs培養(yǎng)的第7天即可檢出nNOS蛋白表達(dá)陽性的CGNs，且隨著時(shí)間的推移逐漸增加，nNOS mRNA的表達(dá)出現(xiàn)在CGNs培養(yǎng)的第4天，然后逐漸增加，一直持續(xù)到第14天。
　　 2.ODN的的細(xì)胞毒性作用
　　 于體外培養(yǎng)7天后分組進(jìn)行ODN轉(zhuǎn)染處理及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。終濃度10μmol/L和20μmol/L的R-ODN處理后的小腦顆粒細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯下降，顯示10μ

10、mol/L及以上濃度的R-ODN產(chǎn)生顯著細(xì)胞毒性作用。
　　 3.AS-ODN最佳轉(zhuǎn)染濃度和轉(zhuǎn)染時(shí)間
　　 終濃度8μmol/L的R-ODN處理72小時(shí)后，F(xiàn)ITC-R-ODN測(cè)定顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最佳，被熒光標(biāo)記的培養(yǎng)細(xì)胞維持正常的形態(tài)和細(xì)胞密度。CGNs培養(yǎng)第7天，F(xiàn)ITC-R-ODN在2小時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)進(jìn)入小腦顆粒細(xì)胞，攝入的細(xì)胞數(shù)在4～8小時(shí)增加，在24至48小時(shí)內(nèi)，累計(jì)超過90％的培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞攝入了FITC-

11、R-ODN，自72小時(shí)始逐漸減少。
　　 4.nNOS AS-ODN抑制發(fā)育期CGNs的nNOS蛋白表達(dá)
　　 使用8μmol/L的nNOS AS-ODN處理72小時(shí)后，小腦顆粒細(xì)胞nNOS的mRNA水平無明顯變化，但是蛋白的表達(dá)較相同濃度的R-ODN對(duì)照組下降了大約59％，較陰性對(duì)照的TE緩沖液組下降了60％，R-ODN組與TE緩沖液組CGNs的nNOS蛋白表達(dá)無顯著性差異。
　　 5.nNOS AS-ODN降

12、低發(fā)育期小腦顆粒細(xì)胞的存活率
　　 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后小腦顆粒細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低。中性紅染色計(jì)數(shù)結(jié)果亦顯示，nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后存活的小腦顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組明顯減少，結(jié)果有顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外成功培養(yǎng)了原代發(fā)育期小腦顆粒細(xì)胞。
　　 2.nNOS蛋白在小腦顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的第7～14天表達(dá)并隨時(shí)間延長而增加。
　　 3.nN