促甲狀腺激素通過PKA通路抑制3T3-L1脂肪細胞中脂肪甘油三酯脂酶的表達.pdf

1、目的:
　　1、脂肪細胞已經(jīng)被證明可以表達功能性TSHR，本課題擬觀察Tshr-/-小鼠附睪脂肪細胞中ATGL的表達;另外在體外實驗中用TSH處理誘導分化成熟的脂肪細胞，觀察TSH對ATGL表達的影響，通過體內實驗及體外實驗來探討TSH在脂解過程中可能發(fā)揮的作用，揭示亞臨床甲減致肥胖的可能分子機制。
　　2、利用cAMP激動劑forskolin和PKA抑制劑H89及TSH分別處理誘導分化成熟的脂肪細胞，觀察細胞中ATGL的表

2、達，以此來觀察cAMP/PKA通路是否參與了TSH對ATGL的作用、揭示其可能的作用機制。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng):按照培養(yǎng)方案將3T3-L1小鼠成纖維細胞通過誘導分化、培養(yǎng)成為成熟的脂肪細胞，在將細胞進行誘導分化的過程中，分別觀察不同天數(shù)時細胞中ATGL的表達。并用0.1μM、1μM、2μ M的bTSH分別處理分化成熟的脂肪細胞24小時及48小時，然后觀察細胞中ATGL表達的變化。
　　2、動物模型:Tshr-

3、/小鼠及Tshr+/+小鼠飼養(yǎng)于屏障(SPF)環(huán)境中，按照白天與夜晚各12小時予以晝夜循環(huán)，飼料和水自由攝入。4-6周斷乳后對雄性小鼠進行基因型鑒定，按照基因型鑒定結果將同窩雄性小鼠分為三組:Tshr+/+、Tshr+/-和Tshr-/-，Tshr-/-組小鼠予以外源性補充T4; Tshr-/小鼠和Tshr+/+小鼠用于實驗。
　　3、利用油紅O染色觀察脂肪細胞內脂滴的情況。
　　4、采用RT-PCR技術檢測細胞中ATGL基

4、因mRNA的表達。
　　5、采用Western Blotting方法檢測細胞中ATGL蛋白的表達。
　　6、采用免疫熒光方法觀察ATGL在脂肪細胞中的表達和分布。
　　7、采用免疫組化方法觀察ATGL在脂肪組織細胞中的表達及分布。
　　8、采用SAS系統(tǒng)和SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用(x)±s做描述，多組均數(shù)比較采用方差分析，方差不齊的采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。
　　結

5、果:
　　1、小鼠Tshr基因敲除后附睪周圍脂肪細胞內ATGL的表達明顯增加
　　我們應用免疫組化技術，觀察了Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中脂肪細胞內ATGL的分布和表達。免疫組化結果顯示:在小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中，脂肪細胞中的脂滴呈空泡狀，細胞核被脂滴擠到一邊，緊貼細胞膜，ATGL呈棕黃色，分布于細胞質中，亦被脂滴擠到一邊、緊貼細胞膜;與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠脂

6、肪組織石蠟切片中，脂肪細胞中ATGL表達增多。同時，我們用Western blotting方法和RT-PCR方法分貝檢測了附睪脂肪組織中ATGL蛋白的表達和mRNA的表達。與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠附睪脂肪細胞中ATGL的蛋白表達及RNA表達都明顯增加，這些都提示TSH可能抑制脂肪細胞中ATGL的表達。
　　2、TSH抑制成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達
　　2.1 在3T3-L1細胞被誘導分化的過程中

7、，細胞中的ATGL的蛋白表達逐漸增加。
　　在3T3-L1前脂肪細胞中，ATGL的蛋白表達量很少，隨著誘導分化過程中天數(shù)的增加，細胞中ATGL的蛋白量逐漸增加，至D16天，80％-90％的前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，ATGL的蛋白表達量最高。
　　2.2 TSH抑制成熟3T3-L1脂肪細胞中ATGL的表達
　　我們分別用0.1μM、1μM、2μM bTSH處理成熟脂肪細胞24小時和48小時，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，b

8、TSH刺激后成熟脂肪細胞內ATGL表達明顯減少:處理24小時后，0.1μM、1μM與2μ M bTSH處理組與對照組相比，細胞內ATGL蛋白含量分別減少了31.1％(p＜0.01)、57.3％(p＜0.01)和58.1％(p＜0.01);處理48小時后，0.1μM、1μM與2μM bTSH處理組與對照組相比，細胞內ATGL蛋白含量分別減少了45.1％(p＜0.01)、60.5％(p＜0.01)和77.1％(p＜0.01)，差異均有統(tǒng)計學

9、意義。bTSH對ATGL的這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性，尤其在細胞被bTSH處理48小時后，不同劑量組間的差異顯著（皆p＜0.01）。但bTSH對ATGL的抑制作用在0.1μM和1μM時并沒有表現(xiàn)出顯著的時間依賴性:0.1μMbTSH分別處理細胞24小時和48小時后，細胞內的ATGL的蛋白表達均減少，但兩組ATGL減少的量之間的差異并不顯著;同樣，應用1μM bTSH分別處理細胞24小時和48小時后，兩組細胞內的ATGL的蛋白表達均減

10、少，但兩組ATGL減少的量之間的差異也并不顯著。但是應用2μ M bTSH分別處理細胞48小時后，細胞內ATGL蛋白表達的減少較處理24小時后ATGL表達的減少更顯著(p＜0.01)。
　　用2μM bTSH處理成熟脂肪細胞48小時后，應用RT-PCR技術觀察細胞中ATGL的mRNA含量變化，結果發(fā)現(xiàn)細胞中ATGL的mRNA的含量較空白對照組減少約70％，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　以上結果顯示，bTSH可以抑

11、制成熟脂肪細胞中ATGL的表達，這種作用呈劑量依賴性。
　　3、TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制ATGL的表達
　　3.1 cAMP激動劑forskolin可以抑制成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達
　　3T3-L1細胞被誘導分化為成熟脂肪細胞后，分別用濃度為2.5uM和5uM的forskolin處理細胞24小時后，應用Western blotting方法檢測細胞中ATGL的蛋白表達，結果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，2

12、.5uM處理組細胞內ATGL蛋白含量減少了47％(p＜0.01)，5uM處理組細胞內ATGL蛋白含量減少了52％(p＜0.01)。
　　3.2 PKA抑制劑H89對于成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達無明顯影響
　　將3T3-L1細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后，分別用濃度為5uM和10uM的H89處理細胞24小時后，應用Western blotting方法檢測細胞中ATGL的蛋白表達，結果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，兩個處理組細胞內

13、ATGL蛋白的含量幾乎無變化(p＞0.05)。
　　3.3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制成熟脂肪細胞內ATGL的表達
　　將3T3-L1細胞誘導分化為成熟的脂肪細胞后，進行實驗。先用10uM的H89預處理細胞1小時，然后加入2uM的bTSH;其它幾皿的細胞，則分別單獨加入2uM的bTSH、5uM的forskolin和10uM的H89，另外一皿細胞則作為空白對照組。細胞被處理24小時后，應用Western blott

14、ing方法和免疫熒光方法檢測細胞中ATGL的表達。Western blotting結果顯示:與對照組相比，bTSH處理細胞組及forskolin處理細胞組細胞內ATGL的表達均明顯受到抑制(p＜0.01，p＜0.01); H89處理細胞組，脂肪細胞內ATGL的蛋白含量無明顯變化;同樣，用H89預處理后再用bTSH處理的細胞組，細胞內ATGL的蛋白含量較對照組也沒有明顯變化。免疫熒光結果與Western blotting結果一致，免疫熒光

15、結果顯示:ATGL表現(xiàn)為紅色熒光，位于成熟脂肪細胞的細胞漿內，與對照組相比，bTSH及forskolin處理組細胞內ATGL的熒光亮度明顯減弱，H89處理組ATGL的熒光亮度較對照組相比無明顯變化，同樣，用H89預處理后再用bTSH處理的細胞組，細胞內ATGL的熒光亮度較對照組也沒有顯著變化。
　　綜合上述結果說明，forskolin可以增加細胞內cAMP含量、激活PKA，從而可以抑制ATGL的表達;而當先利用H89將PKA的活性

16、抑制后，再用TSH處理細胞，TSH與TSHR結合后無法活化PKA，從而無法發(fā)揮TSH對ATGL的抑制作用。
　　結論:
　　1、TSH對脂肪細胞中甘油三酯的分解代謝具有調節(jié)作用。
　　2、TSH可以抑制小鼠成熟脂肪細胞中ATGL的表達。
　　3、TSH通過激活cAMP/PKA通路來發(fā)揮抑制ATGL表達的作用。
　　意義:
　　亞臨床甲減的患病人數(shù)逐漸增加，它與許多疾病相關，但對其的診斷和治療都缺乏有力