PLIN1基因沉默對3T3-L1脂肪細胞脂解的影響及機制探究.pdf

1、目的：采用RNA干擾技術(shù)沉默3T3-L1脂肪細胞中圍脂滴蛋白（PLIN1）基因的表達，觀察對細胞中脂解的影響，并進行分子機制探討，為肥胖癥相關(guān)生物制劑的篩選與制備提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用基因重組技術(shù)構(gòu)建3組陽性sh-PLIN1干擾載體以及1組陰性載體，并通過菌液PCR法和DNA測序法對其進行鑒定。
　　2.3T3-L1前脂肪細胞采用“雞尾酒”法誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)成功后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞2d。
　　3.細

2、胞轉(zhuǎn)染成功后，采用Bodipy493/503染色脂滴，Hoechest33258襯染細胞核；采用酶法檢測細胞中甘油三酯（TG）及甘油的含量，評價細胞脂解情況。
　　4.轉(zhuǎn)染后的細胞通過Western blot法檢測細胞中圍脂滴蛋白A（PLIN1A）、甘油三酯脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）及其磷酸化蛋白（p-HSL）的表達；通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細胞中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）的濃度。

3、另外，異丙腎上腺素（ISO）與sh-PLIN1干擾載體聯(lián)合干預(yù)時，以濃度為10μM的ISO干預(yù)細胞6h。
　　結(jié)果：
　　1.隨著細胞誘導(dǎo)分化的進行，3T3-L1前脂肪細胞體積增大，形態(tài)變圓，并出現(xiàn)脂滴。熒光染色后，脂滴呈“戒環(huán)樣”圍繞細胞核分布，且誘導(dǎo)分化第8d脂滴直徑明顯大于第4d。
　　2.誘導(dǎo)分化第0d、4d和8d，細胞中TG含量呈上升趨勢。
　　3.3T3-L1脂肪細胞轉(zhuǎn)染2d后，各組轉(zhuǎn)染率均大于40％

4、。與陰性轉(zhuǎn)染組相比，3組陽性載體均能顯著下調(diào)PLIN1A蛋白的表達。
　　4.轉(zhuǎn)染sh-PLIN1干擾載體后，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組細胞中脂滴減小，TG含量降低，甘油含量升高；ATGL和HSL表達量顯著升高，p-HSL表達量及cAMP、PKA的濃度均無顯著性差異。
　　5. ISO與sh-PLIN1干擾載體共同干預(yù)細胞后，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，ISO+sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組和sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組中ATGL表達

5、量均顯著升高，且2組之間無明顯差異。同時，ISO+sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組和ISO+陰性轉(zhuǎn)染組中TG含量降低，甘油含量升高；HSL、p-HSL表達量及cAMP、PKA的濃度均顯著升高，并且這些指標在2組中均無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. sh-PLIN1干擾載體構(gòu)建成功，并且可有效下調(diào)PLIN1A蛋白的表達。
　　2. sh-PLIN1干擾載體可促進3T3-L1脂肪細胞脂解，其機制可能通過上調(diào)ATGL和HSL的表達而