裂殖酵母Dis312的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、RNA外切核酸酶是修飾RNA的一個大的核酸酶家族，在許多生命活動過程中發(fā)揮著重要作用。一方面RNA外切核酸酶可以通過降解多余的RNA來調(diào)節(jié)RNA的豐度，并由此來監(jiān)視RNA的代謝。同時，一些RNA前體分子也需要通RNA外切核酸酶的剪切來形成成熟體。
　　Dis312是存在于高等真核生物中的RNA外切核酸酶，在RNA的降解過程中發(fā)揮著重要的作用，它從3'往5'逐個地降解單核苷酸。Dis312位于細(xì)胞質(zhì)中，在基因上與一些在細(xì)胞質(zhì)中參與R

2、NA降解通路的分子有聯(lián)系。例如，在小鼠胚胎干細(xì)胞中Dis312通過降解尿苷化的pre-let-7來阻斷l(xiāng)et-7microRNAs的表達(dá)。人源Dis312的突變可導(dǎo)致Perlman綜合征，引起過增長并可引發(fā)Wilm's腫瘤。另有研究表明Dis312選擇性降解尿苷化的RNA分子，這種活性可被腺苷化的RNA分子所抑制。
　　隨著最近幾年Dis312功能和催化性質(zhì)不斷地被報道，很多研究組也在進(jìn)行Dis312結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。在2014年

3、小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解出（PDB序列號4pmw），該結(jié)構(gòu)和之前解出的Rrp44-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB序列號2nvu）以及RNaseⅡ-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB序列號2ix1）都具有相似的構(gòu)象:三個OB折疊的結(jié)構(gòu)域（CSD1，CSD2和S1結(jié)構(gòu)域）位于負(fù)責(zé)催化的RNB結(jié)構(gòu)域的一側(cè)，形成了RNA分子通道的入口，RNA底物從這個入口進(jìn)入RNB結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部，從而到達(dá)催化RNA降解的活性位點(diǎn)。但是在這三個RNA復(fù)合物的結(jié)

4、構(gòu)中，RNA通道還是有一些明顯的差異。例如，釀酒酵母Rrp44的三個OB折疊結(jié)構(gòu)域所形成的通道相比于Dis312顯得更窄，這是因為CSDs的柔性loop在RNB以及S1結(jié)構(gòu)域的距離上更為緊密，呈現(xiàn)一種關(guān)閉的狀態(tài);而在小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，三個OB折疊的結(jié)構(gòu)域的取向形成一個特別的漏斗狀通道，使得RNA通道顯得更加筆直和開放。
　　小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析首次闡述了Dis312這種外切酶和RNA底物

5、的作用方式，很好地解釋了Dis312選擇特異性結(jié)合尿苷酸鏈的原因。但是對于Dis312的催化機(jī)理仍然還有很多問題有待挖掘。例如Dis312不結(jié)合RNA時的構(gòu)象，Dis312結(jié)合RNA的整體動態(tài)過程等。為了繼續(xù)揭示Dis312的催化機(jī)制，本人解析了2.3(A)的裂殖酵母Dis312的不含RNA底物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中CSDs的取向和小鼠Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)中CSDs的取向出現(xiàn)了很大差別，位于RNB結(jié)構(gòu)域的側(cè)面而遠(yuǎn)離RNB結(jié)構(gòu)域上方的

6、RNA通道入口。從不含RNA的Dis312結(jié)構(gòu)和Rrp44、RNAseⅡ兩個同源物的RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)的比較中也出現(xiàn)了類似差別。對這種構(gòu)象上差別的可能原因分析結(jié)果表明，序列差異和晶體堆積對構(gòu)象差異的影響不大，而RNA的結(jié)合狀態(tài)的不同是不結(jié)合RNA的Dis312結(jié)構(gòu)和復(fù)合物結(jié)構(gòu)出現(xiàn)構(gòu)象差別的主要原因。熒光偏振實驗結(jié)果也顯示RNB和S1參與最初整個酶對RNA分子的結(jié)合;同時CSDs也參與結(jié)合的整個過程。結(jié)合結(jié)構(gòu)比對和突變體結(jié)合實驗的結(jié)果可以推

7、測，由于RNA的結(jié)合，Dis312可能會發(fā)生一個明顯的構(gòu)象變化。
　　目前Dis312-RNA的結(jié)構(gòu)只有小鼠的被解析出來，該工作解析出了首個不含RNA的Dis312晶體結(jié)構(gòu)。此外，該工作也同步解析裂殖酵母Dis312-RNA的結(jié)構(gòu)，來探究Dis312在結(jié)合RNA前后構(gòu)象的變化。由于收到的復(fù)合物衍射數(shù)據(jù)分辨率不高，最終解析出的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中只確定了四分之三的肽鏈的走向（不含CSDs），但是通過檢驗發(fā)現(xiàn)，在已有的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型中，RNB