人源DNA損傷修復(fù)蛋白PTIP和裂殖酵母tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶Trm10的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本論文前兩章介紹了人源DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白PTIP的結(jié)構(gòu)與功能研究。DNA損傷應(yīng)答是對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性所必不可少的細(xì)胞內(nèi)基本的過程，該過程對(duì)于細(xì)胞和有機(jī)體的功能的發(fā)揮至關(guān)重要。在細(xì)胞周期的不同時(shí)期，一旦DNA被內(nèi)源性或外源性的一些因子損傷，許多蛋白都能被招募到DNA損傷位點(diǎn)，這些蛋白在這里可以組成一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而激活DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)途徑中，組蛋白變異體H2AX的C-末端磷酸化是最早發(fā)生

2、的染色質(zhì)修飾，同時(shí)也是DNA修復(fù)過程中一個(gè)重要的早期事件，其目的在于招募DNA損傷修復(fù)蛋白到DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)(DSBs)。值得一提的是，在包含串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域（BRCA1-C-末端結(jié)構(gòu)域）的蛋白中，例如hMDC1，hMCPH1，spBrc1和spCrb2(53BP1在裂殖酵母菌屬中的同源物)，BRCT結(jié)構(gòu)域與H2AX(γH2AX)或磷酸化的H2A(在酵母中為γH2A)結(jié)合。
　　本論文開展了人源PTIP蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，P

3、TIP蛋白包括六個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域:其中兩個(gè)在氨基端，另外四個(gè)在羧基端。已有的研究表明PTIP的第二個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域直接和PA1作用，同時(shí)它的C端四個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域在電離輻射(IR)以后可以與γH2AX共定位形成foci現(xiàn)象。研究表明，通過定向的肽庫(kù)篩選，PTIP BRCT5-BRCT6結(jié)構(gòu)域可以和模式為pS/T-Q-V-F的磷酸化的小肽結(jié)合。人源γH2AX的C末端尾巴有一個(gè)相似的序列模式(pS-Q)，具有與BRCT5-BRCT6結(jié)構(gòu)域結(jié)

4、合的最佳小肽序列，人源PTIP的裂殖酵母同源物Brc1可通過其C-末端的串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域與γH2A相互作用，暗示人源PTIP也可能識(shí)別γH2AX。我們通過熒光偏振實(shí)驗(yàn)證明PTIP BRCT5-BRCT6結(jié)構(gòu)域與γH2AX小肽在體外有很強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而我們解析了2.15埃的BRCT5-BRCT6與γH2AX小肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)表明PTIP BRCT5-BRCT6具有保守的結(jié)合磷酸化底物的殘基，而且對(duì)pSer+3位也有一定的選擇

5、性。我們的研究結(jié)果闡明了人源PTIPBRCT5-BRCT6結(jié)構(gòu)域識(shí)別γH2AX的分子基礎(chǔ)。
　　本論文后兩章節(jié)介紹了裂殖酵母tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶spTrm10的結(jié)構(gòu)與功能研究。tRNA甲基化為tRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能所必需，它不僅影響到蛋白翻譯的效率，而且還與tRNA三維結(jié)構(gòu)的正確折疊有直接的關(guān)系。到目前為止，在tRNA中共發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)的m1G的甲基化:一個(gè)是m1G37，它是由古細(xì)菌和真核生物的Trm5和細(xì)菌中的TrmD催化完成。T

6、rm5屬于經(jīng)典的RFM甲基轉(zhuǎn)移酶家族，而TrmD屬于SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶家族。另外一位是tRNA鳥嘌呤第九位的N1甲基化(m1G)，被發(fā)現(xiàn)在真核生物和古細(xì)菌中廣泛存在，它是由甲基轉(zhuǎn)移酶中的Trm10家族催化完成。
　　Trm10家族與上述的Trm5家族和TrmD沒有任何的序列同源性，為了研究Trm10的催化機(jī)制，在本論文報(bào)道了tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶spTrm10（裂殖酵母）單獨(dú)以及它與甲基供體產(chǎn)物S-腺苷-高半胱氨酸（SAH）復(fù)合物的

7、晶體結(jié)構(gòu)。同時(shí)，我的合作者邵振華也解析了在釀酒酵母同源物scTrm10與SAH的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。我們的晶體學(xué)研究表明裂殖酵母spTrm10家族的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（催化結(jié)構(gòu)域）呈現(xiàn)出典型的SPOUT折疊類型。另外，X-射線小角散射分析表明spTrm10在溶液中以單體形式存在，然而，SPOUT家族中其他的成員均是以同二聚體的形式發(fā)揮功能。我們也進(jìn)行了tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析、等溫滴定熱量測(cè)定實(shí)驗(yàn)(ITC)、凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)以及突變分析等實(shí)