人源DNA損傷修復蛋白PTIP和裂殖酵母tRNA甲基轉移酶Trm10的結構與功能研究.pdf

1、本論文前兩章介紹了人源DNA損傷反應相關蛋白PTIP的結構與功能研究。DNA損傷應答是對于維持基因組的穩(wěn)定性所必不可少的細胞內基本的過程，該過程對于細胞和有機體的功能的發(fā)揮至關重要。在細胞周期的不同時期，一旦DNA被內源性或外源性的一些因子損傷，許多蛋白都能被招募到DNA損傷位點，這些蛋白在這里可以組成一個復雜的相互作用網絡進而激活DNA損傷修復系統(tǒng)。在哺乳動物細胞中的DNA損傷修復途徑中，組蛋白變異體H2AX的C-末端磷酸化是最早發(fā)生

2、的染色質修飾，同時也是DNA修復過程中一個重要的早期事件，其目的在于招募DNA損傷修復蛋白到DNA雙鏈斷裂位點(DSBs)。值得一提的是，在包含串聯BRCT結構域（BRCA1-C-末端結構域）的蛋白中，例如hMDC1，hMCPH1，spBrc1和spCrb2(53BP1在裂殖酵母菌屬中的同源物)，BRCT結構域與H2AX(γH2AX)或磷酸化的H2A(在酵母中為γH2A)結合。
　　本論文開展了人源PTIP蛋白的結構生物學研究，P

3、TIP蛋白包括六個BRCT結構域:其中兩個在氨基端，另外四個在羧基端。已有的研究表明PTIP的第二個BRCT結構域直接和PA1作用，同時它的C端四個BRCT結構域在電離輻射(IR)以后可以與γH2AX共定位形成foci現象。研究表明，通過定向的肽庫篩選，PTIP BRCT5-BRCT6結構域可以和模式為pS/T-Q-V-F的磷酸化的小肽結合。人源γH2AX的C末端尾巴有一個相似的序列模式(pS-Q)，具有與BRCT5-BRCT6結構域結

4、合的最佳小肽序列，人源PTIP的裂殖酵母同源物Brc1可通過其C-末端的串聯BRCT結構域與γH2A相互作用，暗示人源PTIP也可能識別γH2AX。我們通過熒光偏振實驗證明PTIP BRCT5-BRCT6結構域與γH2AX小肽在體外有很強的相互作用，進而我們解析了2.15埃的BRCT5-BRCT6與γH2AX小肽復合物的晶體結構。該結構表明PTIP BRCT5-BRCT6具有保守的結合磷酸化底物的殘基，而且對pSer+3位也有一定的選擇

5、性。我們的研究結果闡明了人源PTIPBRCT5-BRCT6結構域識別γH2AX的分子基礎。
　　本論文后兩章節(jié)介紹了裂殖酵母tRNA甲基轉移酶spTrm10的結構與功能研究。tRNA甲基化為tRNA發(fā)揮其生物學功能所必需，它不僅影響到蛋白翻譯的效率，而且還與tRNA三維結構的正確折疊有直接的關系。到目前為止，在tRNA中共發(fā)現兩個位點的m1G的甲基化:一個是m1G37，它是由古細菌和真核生物的Trm5和細菌中的TrmD催化完成。T

6、rm5屬于經典的RFM甲基轉移酶家族，而TrmD屬于SPOUT甲基轉移酶家族。另外一位是tRNA鳥嘌呤第九位的N1甲基化(m1G)，被發(fā)現在真核生物和古細菌中廣泛存在，它是由甲基轉移酶中的Trm10家族催化完成。
　　Trm10家族與上述的Trm5家族和TrmD沒有任何的序列同源性，為了研究Trm10的催化機制，在本論文報道了tRNA甲基轉移酶spTrm10（裂殖酵母）單獨以及它與甲基供體產物S-腺苷-高半胱氨酸（SAH）復合物的

7、晶體結構。同時，我的合作者邵振華也解析了在釀酒酵母同源物scTrm10與SAH的復合物晶體結構。我們的晶體學研究表明裂殖酵母spTrm10家族的甲基轉移酶結構域（催化結構域）呈現出典型的SPOUT折疊類型。另外，X-射線小角散射分析表明spTrm10在溶液中以單體形式存在，然而，SPOUT家族中其他的成員均是以同二聚體的形式發(fā)揮功能。我們也進行了tRNA甲基轉移酶活性分析、等溫滴定熱量測定實驗(ITC)、凝膠遷移阻滯實驗以及突變分析等實