粟酒裂殖酵母、芽殖酵母、人的tRNA 3′末端加工酶tRNase Z功能保守性的研究.pdf

1、核酸內(nèi)切酶tRNase Z,能促進(jìn)tRNA3'末端加工成熟,這個(gè)過程是tRNA3'-CCA的添加以及后續(xù)tRNA氨基?；仨毜?。在不同的生物中tRNase Z的數(shù)量和類型不同。人中有兩個(gè),一個(gè)是長型(ELAC2)和一個(gè)短型的(ELAC1)。芽殖酵母(Schizosaccharomyces cerevisiae)只有一個(gè)tRNase Z基因(scTRZ1,YKR079c),其編碼的蛋白定位于細(xì)胞核和線粒體中。粟酒裂殖酵母Schizosa

2、ccharomyces pombe中含有兩種tRNase Z基因:sptrz1+(SPAC1D4.10)和sptrz2+(SPBC3D6.03c),它們編碼的蛋白分別定位于細(xì)胞核和線粒體中,我采用綠色熒光蛋白和線粒體染料跟蹤SpTrz2p發(fā)現(xiàn)N端38個(gè)氨基酸是SpTrz2p的線粒體信號(hào)序列。
　　 本實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種sptrz2+是必需基因,低表達(dá)野生型sptrz2+能互補(bǔ)sptrz2+的缺失菌株,但是sptrz2+表達(dá)量過高

3、時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌體死亡。我們使用隨機(jī)孢子分析法和質(zhì)粒穿梭實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SpTrz2p的N端Flag標(biāo)簽和C端Flag標(biāo)簽都會(huì)影響SpTrz2p的生物學(xué)功能,并且在低表達(dá)時(shí),N端Flag標(biāo)簽對(duì)SpTrz2p體內(nèi)功能影響的更大,C端添加5個(gè)Flag標(biāo)簽影響相對(duì)較小。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了SpTrz2p、芽殖酵母的ScTRZ1p和人的ELAC2在裂殖酵母中具有核內(nèi)tRNA前體3'末端加工酶活性,但是質(zhì)粒互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ELAC2和ScTRZ1p都不能替代SpTrz2

4、p缺失,即使在ELAC2和ScTRZ1p前添加SpTrz2p的線粒體信號(hào)肽也不能替代SpTrz2p,這些實(shí)驗(yàn)都表明在體內(nèi)SpTrz1p,SpTrz2p、ScTRZ1p和ELAC2有功能上的差異。為了進(jìn)一步研究SpTrz2p的功能我們采用易錯(cuò)PCR法隨機(jī)突變sptrz2+并置換基因組上的野生型sptrz2+基因構(gòu)建sptrz2+的溫度敏感型突變體,并篩選出了一株溫度敏感型突變體YY-TS,但是該突變體不能被外源表達(dá)SpTrz2p救活。后來