新型免疫毒素mST的表達(dá)、純化及細(xì)胞毒性分析.pdf

1、免疫毒素因具有細(xì)胞選擇性殺傷活性而在一些疾病治療中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。免疫毒素通常由識(shí)別片段和殺傷片段組成，識(shí)別片段決定分子對(duì)細(xì)胞的選擇識(shí)別特性，殺傷片段決定分子的殺傷效率和作用方式[1]?；罨疶細(xì)胞是介導(dǎo)移植排斥的重要細(xì)胞，選擇性清除活化T細(xì)胞可能減輕移植排斥反應(yīng)?；罨疶細(xì)胞表面誘導(dǎo)性表達(dá)T淋巴細(xì)胞相關(guān)毒性抗原4(CTLA-4)分子，因此，利用針對(duì)CTLA4的單鏈抗體為識(shí)別片段，融合能夠作用于細(xì)胞膜的通道形成殺傷片段，構(gòu)建的免疫毒素

2、可能選擇性清除活化T細(xì)胞，具有被開發(fā)為新的免疫抑制劑的潛力。 根據(jù)這一設(shè)想，本研究分別選擇了抗小鼠CTLA-4單鏈抗體mS和能在真菌細(xì)胞膜上打孔的抗真菌肽T為識(shí)別片段和殺傷片段，設(shè)計(jì)了表觀分子量大約為34kD的新型免疫毒素mST；通過(guò)基因工程手段，先后在原核大腸桿菌和真核畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)；進(jìn)而分離純化重組蛋白，并對(duì)其細(xì)胞殺傷活性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1)將mST基因插入原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pQE30載體中，2

3、8℃條件下，經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)菌超聲破碎后，其上清經(jīng)Ni-NTA親和層析，可以獲得少量的可溶性mST蛋白；多數(shù)mST蛋白以不可溶的包涵體形式表達(dá)，包涵體沉淀用6M鹽酸胍進(jìn)行溶解，然后在8M尿素存在的情況下經(jīng)Ni-NTA分離純化，可獲得大量mST包涵體蛋白；在4℃，50 mM Tris-HCl， 1 M Urea， 0.8 M L-Arginine，2 mM GSH， 0.2mM GSSH，pH8.0條件下透析復(fù)性

4、48h，約70％包涵體蛋白可以被復(fù)性，但是，在去除復(fù)性液中殘留變性劑的過(guò)程中，蛋白損失較大，最終蛋白濃度大約只有0.1mg/ml左右。 2)由于包涵體蛋白復(fù)性困難，重復(fù)性差，因此本論文進(jìn)一步選擇能夠分泌表達(dá)重組蛋白的真核畢赤酵母體系對(duì)mST進(jìn)行表達(dá)。將mST基因插入pPIC9K后再通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，長(zhǎng)出的單克隆經(jīng)3輪培養(yǎng)后進(jìn)行Geneticin ?-YPD平板篩選，從1mg/ml的Geneticin?-YPD板上獲得了多

5、拷貝重組子；在28℃，280rpm的條件下培養(yǎng)至OD600=2～6，濃縮10倍后，利用3％甲醇的BMMY誘導(dǎo)96h，從100ml培養(yǎng)上清中可獲得0.1mg目的蛋白。 3)活性分析發(fā)現(xiàn)，從大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分離純化的可溶mST在0.5，1和2 uM濃度下，對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞(EL4)的殺傷率分別為36％±11.2％，44％±3.8％，64％±9.1％；從包涵體復(fù)性獲得的mST在0.5，1和2 uM濃度下對(duì)EL4的殺傷率分別為24％±1

6、3.1％，45％±10.1％，62％±10％；而從畢赤酵母表達(dá)體系中獲得的mST在1uM濃度下對(duì)EL4的殺傷率為37.5％±2.2％。而單鏈抗體mS在這些濃度下對(duì)EL4沒(méi)有明顯殺傷作用。 上述結(jié)果表明，mST在大腸桿菌中以可溶和包涵體形式表達(dá)，但主要為不具活性的包涵體；在畢赤酵母PIC9K體系中以可溶蛋白形式表達(dá)，但產(chǎn)量不高，大約每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基可獲得1mg蛋白；活性分析發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的mST對(duì)EL4細(xì)胞均表現(xiàn)了一定的殺傷，表明該