南海石頭魚毒素的分離純化、毒性測定、分子克隆及原核表達研究.pdf

1、石頭魚生活在印度洋和太平洋的熱帶及亞熱帶淺水區(qū)域，是世界上毒性最強的魚。其毒液可以引起一系列中毒癥狀，如劇痛、水腫、肌肉麻痹、低血壓等。目前已在石頭魚粗毒液中分離出毒素neoVTX。中國海域的石頭魚為玫瑰毒鲉,主要分布于南海海域。
　　目的：獲得南海石頭魚毒素的毒性狀況、組分的蛋白質序列及蛋白質表達方法，為其抗毒素的制備及石頭魚刺傷的防治奠定基礎。
　　方法：提取南海石頭魚的粗毒液,利用SDS-PAGE及MS鑒定粗毒液的主要

2、成分，再用GF-HPLC小量分離粗毒液的主要成分，然后用AKTA蛋白質分離系統對粗毒液進行大量分離，并測定粗毒液及其分離組分的LD50；分離石頭魚毒囊組織,提取石頭魚毒囊RNA,運用RACE技術,獲得毒素的cDNA全序列，連入pET-22b(+)中，進行原核表達。
　　結果：
　　1.在粗毒液的電泳條帶中，發(fā)現了2個已知蛋白質和4個未知蛋白質。其中2個已知蛋白質被鑒定為已報道的neoVTXα、β亞基；4個未知蛋白質中，有2個

3、蛋白質與已報道的neoVTXβ條帶有最高匹配度；另有2個分別與β微管蛋白，3-磷酸甘油醛脫氫酶匹配度最高；
　　2.對粗毒液進行 GF-HPLC分離后，發(fā)現了5種尚未報道的分子量約為14KD的小分子蛋白質；
　　3.粗毒液對小鼠的LD50（i.v.）為106ng/g，neoVTX對小鼠的LD50（i.v.）為66ng/g，分子量約為14KD的小分子蛋白質在278ng/g時，對小鼠完全沒有中毒癥狀及致死性；
　　4.成功

4、克隆了neoVTXα和β亞基的cDNA序列，與沖繩海域玫瑰毒鲉的neoVTXα和β的cDNA序列均具有高達99％的序列同源性；
　　5.以pET-22b(+)為表達載體，Rosetta感受態(tài)細胞為宿主，對neoVTXα和β亞基進行原核表達，成功表達了neoVTXα，產率為0.45mg/L；β亞基未能成功表達。
　　結論：
　　1.玫瑰毒鲉粗毒液的成分除 neoVTX外，還有至少3類蛋白質：第1類是與neoVTXβ有較高