金環(huán)蛇毒細胞毒素的分離純化及其抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、目的：從金環(huán)蛇毒中分離純化細胞毒素，并測定其抗腫瘤活性。
　　 方法：采用低溫高速離心法對金環(huán)蛇毒進行層析前的預處理，取上清溶液，經(jīng)Sephadex G-75柱進行洗脫，收集各組分，將各組分進行紅細胞溶血試驗，初步篩選具有細胞毒素作用的組分。將具有細胞毒素作用的活性峰溶液經(jīng)CM-Sepharose CL-6B離子交換柱進行梯度洗脫，收集各組分。將各組分溶液進行小鼠毒性實驗和離體豚鼠心臟灌流實驗，鑒定活性蛋白質(zhì)峰的細胞毒性作用。將

2、有細胞毒性的蛋白質(zhì)峰溶液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，鑒定蛋白質(zhì)純度及測定分子量。采用MTT法檢測該細胞毒素活性組分對體外培養(yǎng)腫瘤細胞生長的影響。
　　 結(jié)果：金環(huán)蛇毒粗毒經(jīng)Sephadex G-75柱洗脫獲得4個蛋白質(zhì)峰，其中蛋白質(zhì)峰Ⅱ、Ⅲ溶液可致紅細胞重度溶血，表明其具有細胞毒作用。將蛋白質(zhì)峰Ⅱ、Ⅲ溶液經(jīng)CM-Sepharose CL-6B離子交換柱進行梯度洗脫，獲得A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 10個蛋白質(zhì)峰，

3、對10個蛋白質(zhì)組分進行小鼠毒性實驗及豚鼠離體心臟灌流實驗，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)峰C組分和蛋白質(zhì)峰D組分均可致小鼠死亡，能使離體豚鼠的Langen-dorff心臟收縮力短暫增強后迅速減弱，心率減慢，心臟攣縮，最后停搏，呈現(xiàn)明顯的心臟毒素作用，而其它蛋白質(zhì)峰組分對豚鼠離體心臟無明顯毒性作用。對蛋白質(zhì)峰C和蛋白質(zhì)峰D組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，均顯示單一條帶，分子量為7000～8000da。體外抑瘤實驗結(jié)果顯示，不同濃度的蛋白質(zhì)峰C和D組分對

4、MGC-803細胞、Hela細胞、BEL-7402細胞均有明顯的生長抑制作用，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，對三株腫瘤細胞的生長抑制作用逐漸增強，呈一定的濃度依賴性關系。當質(zhì)量濃度為5.0μg/ml、10.0μg/ml時，蛋白質(zhì)峰C組分和D組分對MGC-803細胞、Hela細胞、BEL-7402細胞三株腫瘤細胞的生長抑制率與5-Fu對照組比較，差異均有顯著意義(P＜0.01)。而在同一質(zhì)量濃度下，蛋白質(zhì)組分C和蛋白質(zhì)組分D對三株腫瘤細胞的生長

5、抑制率比較，差異均無顯著性(P＞0.05)。蛋白質(zhì)峰C組分對MGC-803細胞、Hela細胞、BEL-7402細胞作用24h的IC50分別為0.857μg/ml、0.406μg/ml、0.287μg/ml；蛋白質(zhì)峰D組分對MGC-803細胞、Hela細胞、BEL-7402細胞作用24h的IC50分別為0.502μg/ml、0.417μg/ml、0.704μg/ml。
　　 結(jié)論：應用凝膠過濾、離子交換等方法可以從金環(huán)蛇毒中分離純