AMPK在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥和重塑形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、氣道重塑被認(rèn)為是影響支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素，可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和不可逆氣流受限，其主要病理改變包括杯狀細(xì)胞增生、氣道平滑肌增殖肥大、上皮下纖維化、氣道壁新生血管增多等。其中，氣道粘膜下和固有層新生血管增多作為氣道重塑的重要組分，在慢性哮喘的早期就可出現(xiàn)，且與患者的病情嚴(yán)重程度有著明顯的正相關(guān)關(guān)系。因而抑制哮喘氣道新生血管形成對(duì)防治哮喘有重要意義。
　　腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinas

2、e，AMPK）是細(xì)胞代謝和氧化還原的感受調(diào)節(jié)器，參與糖尿病、肥胖、心血管疾病、哮喘、腫瘤等多種疾病的發(fā)生。近年研究表明AMPK活性對(duì)血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞的生物特性發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可能通過(guò)抗氧化、抗炎、抗增殖等途徑影響細(xì)胞功能。然而，AMPK活性變化與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有何關(guān)系研究很少。二甲雙胍（metformin，MET）作為AMPK的一種激動(dòng)劑，通過(guò)抑制線粒體呼吸，使得AMP/ATP比值增加激活A(yù)MPK。本課題以二甲雙胍為主

3、要干預(yù)對(duì)AMPK在慢性哮喘小鼠氣道炎癥、重塑形成中的作用進(jìn)行了探討，并就其與內(nèi)皮細(xì)胞增殖之間的關(guān)系及可能的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　目的：
　　⑴觀察AMPK活化對(duì)慢性哮喘小鼠氣道炎癥、重塑及新生血管形成的影響。
　　⑵了解慢性哮喘小鼠AMPK活化情況和二甲雙胍干預(yù)后AMPK磷酸化情況。
　?、浅醪教剿鞫纂p胍激活A(yù)MPK對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其與細(xì)胞周期相關(guān)分子SKP2及P27的關(guān)系。
　　方法和

4、結(jié)果：
　　⑴采用卵白蛋白（ovalbumin,OVA）致敏并激發(fā)制備慢性哮喘小鼠模型，給予二甲雙胍（metformin）干預(yù)，與生理鹽水對(duì)照組、慢性哮喘模型組相比，觀察到二甲雙胍能減少哮喘肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比，降低外周血血清OVA特異性IgE，抑制肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、TGF-β和MMP-9的表達(dá)。⑵慢性哮喘組病理染色可見(jiàn)氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積等病理改

5、變；免疫組化示氣道周α-SMA、MMP-9、TGF-β表達(dá)水平明顯增加；二甲雙胍組部分抑制了上述病理改變及其蛋白表達(dá)。
　?、鞘褂肊lisa試劑盒檢測(cè)外周血VEGF、sCXCR4、SDF-1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組較對(duì)照組升高，而二甲雙胍可部分抑制其升高。免疫組化CD31染色觀察到慢性哮喘組小鼠氣道上皮下新生血管數(shù)目和面積增加；免疫熒光CD31染色也觀察同樣結(jié)果；二甲雙胍組部分抑制新生血管的形成。
　?、纫苑谓M織Western

6、Blot測(cè)定AMPK總量和磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)慢性哮喘模型組p-AMPK/AMPK表達(dá)水平較對(duì)照組下降,二甲雙胍干預(yù)后p-AMPK/AMPK表達(dá)水平升高；肺組織免疫組化p-AMPK染色觀察到慢性哮喘模型組氣道壁陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組下降，給予二甲雙胍能阻止或減輕這種下降。提示慢性哮喘小鼠氣道AMPK的活性受到抑制，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK發(fā)揮上述作用。
　?、刹捎枚纂p胍激活A(yù)MPK，Compound C抑制AMPK信號(hào)通路，以明確激活A(yù)

7、MPK能否抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并揭示其分子機(jī)制。免疫印跡法檢測(cè)p-AMPK/AMPK、SKP2、P27蛋白水平。實(shí)驗(yàn)顯示：二甲雙胍激活A(yù)MPK后抑制SKP2表達(dá)，增加P27表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。這一作用具有劑量依賴性。
　　結(jié)論：
　　⑴本實(shí)驗(yàn)研究了二甲雙胍對(duì)小鼠慢性哮喘模型氣道炎癥及氣道重塑的影響，研究表明二甲雙胍減輕哮喘小鼠氣道炎癥、抑制粘液分泌、上皮下纖維化、氣道平滑肌增厚及