Rho-Rho激酶在哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應中的作用及干預.pdf

1、目的：探討RhoA／ROCK信號通路在哮喘小鼠發(fā)病機制中的作用及其調控。(1)建立過敏性哮喘小鼠模型并觀察模型RhoAmRNA、ROCKII蛋白及ROCKIImRNA表達情況。(2)探討Rho／ROCK信號通路與氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑的關系。(3)研究ROCKII阻滯劑Y-27632和川芎嗪對氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑和肺組織RhoA、ROCKII表達的影響。(4)觀察地塞米松對氣道重塑和肺組織RhoA、ROCKII表達

2、的影響。 方法：雄性BALB／C小鼠49只，4-6周，隨機分為五組，每組10只(其中A組9只)：A組(正常對照組)，B組(哮喘模型組)，C組(川芎嗪干預組)，D組(地塞米松干預組)，E組(Y-27632干預組)。正常組用生理鹽水，模型組及各干預組用OVA／A1(OH)3混合凝膠于第1、14天腹腔注射(i．p)致敏，第25天開始激發(fā)，每日一次，每次30分鐘，連續(xù)7天。激發(fā)前半小時，C組予腹腔注射川芎嗪(80mg／kg)、D組予地塞

3、米松(0．5mg／kg)、E組予ROCKH阻滯劑Y-27632(4mg／kg)干預，其余兩組以生理鹽水代替。末次激發(fā)后24小時檢測小鼠氣道高反應性，處死小鼠用固相夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測血清及BALF液中腫瘤壞死因子-Q(TNF-Q)水平，對BALF液行細胞總數(shù)計數(shù)，BALF液沉渣涂片作細胞分類計數(shù)，外周血涂片細胞分類計數(shù)，肺組織作病理檢測觀察肺組織結構、氣道平滑肌厚度和氣管壁厚度變化及超微結構變化，免疫組化、RT-P

4、CR法測Rho／ROCK信號通路關鍵分子的表達情況等。 結果： 1. 細胞計數(shù)及分類計數(shù)：B組BALF液細胞總數(shù)【(4．7+2．83)×10'／L】、嗜酸細胞百分比【(8．9+4．38)％】、外周血嗜酸細胞百分比【(5．60+2．80)％】均顯著高于A組【分別為(0．38+0．52)×109/L、(0．n±0．33)％、0】(均P<0．01)；C組【分別為(3．22±2．73)×10'／L、(5．89±2．85)％、(3

5、．78±1．99)％】、D組【分別為(2．4±1．35)×109／[,、(6．15+2．94)％、(3．10+2．23)％】、E組【分別為(3．87+2．95)×109／L、(5．51±3．86)％、(2．08±1．68)％1，均低于B組但高于A組(P<0．05或P<0．01。 2．光鏡：小鼠肺組織切片HE染色A組支氣管和血管周圍未見炎性細胞浸潤，細支氣管平滑肌未出現(xiàn)增殖情況；B組可見支氣管和血管周圍炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、E

6、OS和中性粒細胞為主，支氣管上皮多處斷裂，并有基底膜增厚和平滑肌肥大等表現(xiàn)。C組、D組、E組上述改變程度不一，均比B組輕，其中以D組最為輕微，接近于A組。 3．電鏡：電鏡下A組顯示正常的肺泡隔和肺泡U型上皮細胞，支氣管纖毛上皮排列整齊；B組肺泡隔明顯增厚，炎癥細胞增多，基底膜增厚，肺泡II型上皮細胞腫脹，出現(xiàn)板層小體及線粒體空泡現(xiàn)象，支氣管上皮細胞纖毛排列稀疏；C組、D組、E組上述改變程度不一，均比B組輕，其中以D組最為輕微。

7、 4．支氣管壁厚度Ova0和平滑肌厚度OVam)：B組小鼠Wat【(79．765±15．219)μm2／μm]、Wam【(25．480±3．608)um2/μm】較對照組{Wat【(38．963±9．944)um2／μm]、Wam【(13．700±1．137)μm2／μm]}增加(P<0．01)，各干預組中C組{War[(69．098±9．435)μmZ／μm}、Wam[(22．025±3．724)μm2／μm】)、D組(Wat[

8、(58．946±9．807)μm2／μm】、Wam【(18．645±2．709)μm2／pm】)、E組(Wat【(69．076±7．670)μm2／μm]、Wam【(21．699±5．962)μm2／u叫)均較哮喘組減低(P<0．05或P<0．01)，但比A組仍有所增加(P<0．01)。 5．各組小鼠氣道反應性檢測結果：B組小鼠氣道阻力增加幅度和肺動態(tài)順應性下降幅度明顯高于對照組(P<0．01)，各哮喘干預組與哮喘組比較氣道高反

9、應性下降，但仍高于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0．01或P<0．05)。 6．血清、BALF液中TNF-α濃度：哮喘組血清TNT—Q濃度【(33．019-t-19．148)pg／ml】及BALF液TNF—Q含量【(322．7604-112．611)pg／ml】均較對照組高{分別為(【4．814±2．084)pg／m~】、【(94．867±32．507)pg／rd】)(P<0．05或P<0．01)，c組分別為{[(25．53

10、5±8．277)pg／ml】、[(194．662±100．040)pg／ml】)、D組分別為{【(13．000±5．754)pg／ml】、【(162．7424-40．148)pffn~】)和E組分別為{[(22．214±12．616)pg／m~】、[(212．414±115．952)pg／rd])均有所升高，但低于哮喘組(P<0．05或P<0．01)，各干預組間相比無顯著性差異(P>0．05)。 7．免疫組化檢測ROCKⅡ蛋白表

11、達結果：哮喘組小鼠肺組織ROCKII蛋白表達(0．452±0．052)明顯高于對照組(0．334±0．024)(P<0．01)，C組(0．40494-O．022)、D組(0．374±0．025)和E組(0．403±0．033)均有所升高，但低于哮喘組(P<0．05或P<0．01)。A組蛋白表達水平最低。 8．RT-PCR檢測RhoA、ROCKⅡmRNA表達的結果：RhoA、ROCKIImRNA表達呈明顯的一致性：B組[RhoAm

12、RNA(5．007±1．219)、ROCKIImRNA(7．449±1．429)】均明顯高于A組[RhoAmRNA(3．291±0．737)、ROCKⅡmRNA(2．715±0．733)】(P<0．05或P<0．01)，其余三組呈不同程度的升高，介于A組和B組之間(P<0．05或P<0．01)。 9．相關分析：(D肺組織中RhoAmRNA含量與TNF—Q濃度、氣道管壁厚度及平滑肌厚度呈正相關。(2)肺組織中ROCKII蛋白及mR

13、NA表達與TNF—Q濃度、BALF液細胞總數(shù)、氣道管壁厚度及平滑肌厚度呈正相關，與PC25Raw和PCIsCydn呈負相關。(3)BALF及血清中細胞因子TNF-Q濃度與細胞總數(shù)、War、Wam成正相關，與PC25Raw和PCIsCdyn呈負相關。 結論： 1. 哮喘小鼠肺組織RhoA及ROCKII表達增多，其與氣道炎癥因子、氣道壁厚度、氣道平滑肌厚度呈正相關，ROCKII表達與PC25Raw和PCisCydn呈負相關。