酪酸梭菌對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑防治作用的研究.pdf

1、背景：
　　支氣管哮喘是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的慢性疾病之一，全球哮喘防治創(chuàng)議（GINA）委員會(huì)于2014年對(duì)哮喘的定義進(jìn)行了重要更新，將其定義為“一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀病史，伴有可變的呼氣氣流受限，呼吸道癥狀和強(qiáng)度可隨時(shí)間而變化”[1]。目前哮喘的發(fā)病率和死亡率正在逐年增長(zhǎng)，但尚無(wú)有效的根治方法，嚴(yán)重困擾著人類健康。因此，尋求一種安全有效的哮喘防治藥物仍迫切需要。

2、　　腸道微生物的改變會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏性疾病和哮喘的發(fā)病[2,3]。因此，近年來(lái)許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)企圖通過(guò)建立哮喘模型并給予哮喘小鼠口服益生菌來(lái)降低哮喘的發(fā)病率。益生菌（Probiotics）被定義為：“當(dāng)足量補(bǔ)充時(shí)，對(duì)宿主健康有益的活的微生物”[4]。益生菌可以通過(guò)改變宿主的免疫功能對(duì)過(guò)敏性疾病產(chǎn)生保護(hù)作用[5]。一些益生菌，例如乳酸桿菌和雙歧桿菌已經(jīng)被作為過(guò)敏性疾病防治的新藥廣泛研究[5,6]，但是關(guān)于酪酸梭菌對(duì)過(guò)敏性疾病保護(hù)作用的研究卻未見(jiàn)報(bào)道

3、。
　　目的：
　　我們的實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的小鼠哮喘模型并給予哮喘小鼠口服酪酸梭菌，利用FlexiVent系統(tǒng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中白細(xì)胞及其分類，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶1（mMCP-1）、細(xì)胞因子、OVA特異性免疫球蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）水平，組織學(xué)觀察肺組織病理變化。本研究的目的就是探討酪酸梭菌對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的預(yù)防和治療作用，為哮喘的防治奠定

4、理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）建立小鼠哮喘模型：本實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為對(duì)照組、哮喘組、酪酸梭菌預(yù)防組及治療組。除對(duì)照組外其余三組小鼠于實(shí)驗(yàn)的第7d和第14d天腹腔注射含有OVA及AL(OH)3的生理鹽水溶液進(jìn)行致敏，于實(shí)驗(yàn)的第21~28天分別放在5L的密閉容器中，以1％OVA溶液連續(xù)霧化8天，每天1次，每次30min。在相同條件下，空白對(duì)照組小鼠僅注射含有AL(OH)3的生理鹽水溶液，注射方法、劑量及部位與實(shí)驗(yàn)組相同，采

5、用生理鹽水霧化激發(fā)。
　?。?）口服酪酸梭菌：預(yù)防組小鼠于實(shí)驗(yàn)第0~14d口服灌胃酪酸梭菌溶液進(jìn)行預(yù)防給藥，治療組小鼠于實(shí)驗(yàn)第15~28d口服酪酸梭菌溶液進(jìn)行治療給藥，給藥方法（灌胃）同預(yù)防組。哮喘組小鼠于實(shí)驗(yàn)第0~28d口服灌胃等量生理鹽水。
　?。?）實(shí)驗(yàn)第29天，麻醉小鼠氣管插管，霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿（0,1.5,3…100mg/ml），測(cè)定氣道高反應(yīng)性。
　?。?）采集小鼠全血并分離血清，測(cè)定血清中mM

6、CP-1、細(xì)胞因子、OVA特異性免疫球蛋白及MMP-9水平。
　?。?）支氣管肺泡灌洗，光鏡觀察肺泡灌洗液中白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)，測(cè)定肺泡灌洗液中mMCP-1、細(xì)胞因子及MMP-9水平。
　?。?）分離小鼠肺組織，組織學(xué)方法觀察肺組織病理變化。
　?。?）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　?。?）成功建立小鼠哮喘模型。
　?。?）氣道阻力：與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠氣道阻力明顯升高（basal,1.5,3,12

7、,25,50,100mg/ml Mch），與哮喘組相比，酪酸梭菌可以降低預(yù)防組（25,50mg/ml Mch）和治療組(12,25,50,100mg/ml Mch)小鼠氣道阻力。
　?。?）肺部炎細(xì)胞的浸潤(rùn)：與對(duì)照組小鼠相比，哮喘組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)明顯升高(P<0.05)，主要表現(xiàn)為嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的升高；酪酸梭菌可以明顯降低預(yù)防組(P<0.01)和治療組(P<0.01)小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)，均表現(xiàn)

8、為嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的降低。
　?。?）肥大細(xì)胞脫顆粒：與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺泡灌洗液(P<0.001)和血清(P<0.01)中mMCP-1明顯升高；酪酸梭菌可以有效降低預(yù)防組(P<0.001)和治療組(P<0.01)小鼠血清中 mMCP-1的表達(dá)；但是酪酸梭菌對(duì)于肺泡灌洗液中mMCP-1的表達(dá)沒(méi)有明顯的抑制作用(P>0.05)。
　　（5）細(xì)胞因子的表達(dá)：與對(duì)照組小鼠相比，哮喘組小鼠肺泡灌洗液和血清中 Th2細(xì)胞因

9、子(IL-4,IL-5,IL-13,IL-17)明顯升高，酪酸梭菌可以有效抑制肺泡灌洗液和血清中Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，但是預(yù)防組小鼠肺泡灌洗液中IL-13沒(méi)有明顯變化(P>0.05)；與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠血和肺泡灌洗液中 Th1細(xì)胞因子INF-γ及抗炎細(xì)胞因子IL-10均明顯降低，口服酪酸梭菌后明顯升高，但是治療組小鼠肺泡灌洗液中IL-10卻沒(méi)有明顯變化(P>0.05)。
　　（6）OVA特異性免疫球蛋白 IgE/G1：與對(duì)照

10、組相比，哮喘組小鼠血清中 IgE/G1明顯升高，口服酪酸梭菌后，預(yù)防組和治療組小鼠血清中IgE/G1明顯降低，與預(yù)防組相比，治療組小鼠血清中IgG1降低更顯著。
　　（7）MMP-9的表達(dá)：與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺泡灌洗液(P<0.01)和血清(P<0.05)中 MMP-9明顯升高；與哮喘組相比，接受酪酸梭菌口服的小鼠肺泡灌洗液(P<0.01)和血清(P<0.05)中MMP-9明顯降低。
　　（8）組織學(xué)分析：與對(duì)照組相比

11、，哮喘組小鼠肺部炎癥明顯加重，氣道上皮下膠原纖維沉積，氣道上皮中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和Ki67的表達(dá)明顯增多，口服酪酸梭菌后，預(yù)防組和治療組小鼠肺部炎癥減輕，膠原纖維數(shù)量、α-SMA及Ki67的表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　酪酸梭菌能夠有效降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性；減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；抑制肥大細(xì)胞脫顆粒；糾正Th1/Th2失衡；降低OVA特異性抗體的表達(dá)；減少氣道上皮下膠原沉積；抑制MMP-9、α-SMA及K