白藜蘆醇苷抑制磷脂酶A2緩解內毒素性肺損傷的機制研究.pdf

1、第一部分：白藜蘆醇苷上調Clara細胞分泌蛋白表達緩解大鼠內毒素休克性肺損傷
　　目的：研究白藜蘆醇苷(PD)對內毒素休克大鼠肺組織中Clara細胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表達的影響及量效關系。
　　方法：將50只SD大鼠隨機分為5組(n=10)：正常對照組(A組)、內毒素休克模型組(B組)、PD1mg·kg-1治療組(C組)、PD1mg·kg-1預防組(D組)和PD對照組(E組)。
　　再將48只SD大鼠隨機分

2、為PD治療組(n=24)和PD預防組(n=24)，每組再隨機均分為4個小組(n=6)，分別按1mg·kg-1、5mg·kg-1、10mg·kg-1、30mg·kg-1給予PD。
　　采用Real-time PCR法檢測各組大鼠肺組織中CCSP、sPLA2和cPLA2的基因表達，采用Western-blot法檢測各組大鼠肺組織中CCSP的蛋白表達，免疫組化法記數(shù)各組CCSP陽性細胞數(shù)，ELISA法檢測各組大鼠血清中CCSP水平，并結

3、合HE染色病理圖片觀察各組大鼠肺損傷的程度。
　　結果：與正常對照組相比，內毒素休克模型組大鼠肺組織中sPLA2和cPLA2mRNA表達顯著增高，血清和肺組織中CCSP的基因和蛋白表達均明顯降低；白藜蘆醇苷不僅可顯著促進CCSP在正常大鼠肺組織中的表達，還可促進內毒素休克大鼠肺組織表達CCSP，且預防組明顯多于治療組，從而降低肺組織中sPLA2和cPLA2mRNA表達，減輕肺損傷的程度。在觀察劑量內，隨著PD劑量的增加，CCSP的

4、基因和蛋白表達呈增加的趨勢，肺損傷的程度逐漸減輕。
　　結論：CCSP是磷脂酶A2的內源性抑制劑，PD可呈劑量依賴性上調內毒素休克大鼠肺組織中CCSP的基因和蛋白表達，對抗磷脂酶A2的損傷作用，實現(xiàn)肺保護，可能是白藜蘆醇苷的重要作用機制之一。
　　第二部分：白藜蘆醇苷對內毒素誘導的BEAS-2B細胞中CCSP表達和Ca2+濃度的影響
　　目的：探討白藜蘆醇苷(PD)對內毒素(LPS)誘導的人支氣管上皮細胞(BEAS-2

5、B)中Clara細胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表達以及對Ca2+濃度的影響。
　　方法：培養(yǎng)BEAS-2B細胞，MTT比色法篩選PD和LPS最佳濃度；然后復制LPS誘導的BEAS-2B細胞炎癥反應模型，實驗分為正常對照組、LPS模型組、LPS+PD組、PD+LPS組、PD對照組；Real-time PCR法檢測CCSP mRNA的表達量；Western-blot法檢測CCSP蛋白含量；流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度。

6、　　結果：經(jīng)過MTT法篩選，PD的最適濃度為0.5 mmol·L-1，LPS的最適儂度為100 mg·L-1，各組CCSP mRNA表達情況為：PD+LPS組>PD對照組>正常對照組>LPS+PD組>LPS模型組。各組CCSP蛋白表達情況為：PD對照組>PD+LPS組>正常對照組>LPS+PD組>LPS模型組，各組Ca2+濃度如下：LPS模型組>LPS+PD組>PD+LPS組>正常對照組>PD對照組。
　　結論：在內毒素誘導的BE

7、AS-2B細胞中，PD可以促進CCSPmRNA和蛋白的表達，降低胞內Ca2+濃度，預防性應用的效果明顯優(yōu)于治療組，因此通過體外實驗研究進一步證明PD對內毒素性肺損傷的保護作用可能與其對CCSP和Ca2+濃度的調節(jié)有關。
　　第三部分：白藜蘆醇苷作為一種PLA2抑制劑的體外篩選
　　目的：探討白藜蘆醇苷(PD)是否是一種PLA2抑制劑。
　　方法：以大豆磷脂酰膽堿為底物，通過分光光度法測定PLA2水解底物產(chǎn)生游離脂肪酸的