白藜蘆醇苷抑制磷脂酶A2緩解內(nèi)毒素性肺損傷的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：白藜蘆醇苷上調(diào)Clara細(xì)胞分泌蛋白表達(dá)緩解大鼠內(nèi)毒素休克性肺損傷
　　目的：研究白藜蘆醇苷(PD)對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠肺組織中Clara細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表達(dá)的影響及量效關(guān)系。
　　方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：正常對(duì)照組(A組)、內(nèi)毒素休克模型組(B組)、PD1mg·kg-1治療組(C組)、PD1mg·kg-1預(yù)防組(D組)和PD對(duì)照組(E組)。
　　再將48只SD大鼠隨機(jī)分

2、為PD治療組(n=24)和PD預(yù)防組(n=24)，每組再隨機(jī)均分為4個(gè)小組(n=6)，分別按1mg·kg-1、5mg·kg-1、10mg·kg-1、30mg·kg-1給予PD。
　　采用Real-time PCR法檢測各組大鼠肺組織中CCSP、sPLA2和cPLA2的基因表達(dá)，采用Western-blot法檢測各組大鼠肺組織中CCSP的蛋白表達(dá)，免疫組化法記數(shù)各組CCSP陽性細(xì)胞數(shù)，ELISA法檢測各組大鼠血清中CCSP水平，并結(jié)

3、合HE染色病理圖片觀察各組大鼠肺損傷的程度。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素休克模型組大鼠肺組織中sPLA2和cPLA2mRNA表達(dá)顯著增高，血清和肺組織中CCSP的基因和蛋白表達(dá)均明顯降低；白藜蘆醇苷不僅可顯著促進(jìn)CCSP在正常大鼠肺組織中的表達(dá)，還可促進(jìn)內(nèi)毒素休克大鼠肺組織表達(dá)CCSP，且預(yù)防組明顯多于治療組，從而降低肺組織中sPLA2和cPLA2mRNA表達(dá)，減輕肺損傷的程度。在觀察劑量內(nèi)，隨著PD劑量的增加，CCSP的

4、基因和蛋白表達(dá)呈增加的趨勢，肺損傷的程度逐漸減輕。
　　結(jié)論：CCSP是磷脂酶A2的內(nèi)源性抑制劑，PD可呈劑量依賴性上調(diào)內(nèi)毒素休克大鼠肺組織中CCSP的基因和蛋白表達(dá)，對(duì)抗磷脂酶A2的損傷作用，實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)，可能是白藜蘆醇苷的重要作用機(jī)制之一。
　　第二部分：白藜蘆醇苷對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中CCSP表達(dá)和Ca2+濃度的影響
　　目的：探討白藜蘆醇苷(PD)對(duì)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2

5、B)中Clara細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)基因和蛋白表達(dá)以及對(duì)Ca2+濃度的影響。
　　方法：培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，MTT比色法篩選PD和LPS最佳濃度；然后復(fù)制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、LPS模型組、LPS+PD組、PD+LPS組、PD對(duì)照組；Real-time PCR法檢測CCSP mRNA的表達(dá)量；Western-blot法檢測CCSP蛋白含量；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

6、　　結(jié)果：經(jīng)過MTT法篩選，PD的最適濃度為0.5 mmol·L-1，LPS的最適儂度為100 mg·L-1，各組CCSP mRNA表達(dá)情況為：PD+LPS組>PD對(duì)照組>正常對(duì)照組>LPS+PD組>LPS模型組。各組CCSP蛋白表達(dá)情況為：PD對(duì)照組>PD+LPS組>正常對(duì)照組>LPS+PD組>LPS模型組，各組Ca2+濃度如下：LPS模型組>LPS+PD組>PD+LPS組>正常對(duì)照組>PD對(duì)照組。
　　結(jié)論：在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的BE

7、AS-2B細(xì)胞中，PD可以促進(jìn)CCSPmRNA和蛋白的表達(dá)，降低胞內(nèi)Ca2+濃度，預(yù)防性應(yīng)用的效果明顯優(yōu)于治療組，因此通過體外實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證明PD對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的保護(hù)作用可能與其對(duì)CCSP和Ca2+濃度的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　第三部分：白藜蘆醇苷作為一種PLA2抑制劑的體外篩選
　　目的：探討白藜蘆醇苷(PD)是否是一種PLA2抑制劑。
　　方法：以大豆磷脂酰膽堿為底物，通過分光光度法測定PLA2水解底物產(chǎn)生游離脂肪酸的