褪黑素對大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的影響及其機制初探.pdf

1、目的：急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是臨床常見的由感染等多種因素引起的彌漫性肺實質(zhì)損傷，也是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)在肺部的典型表現(xiàn)。ALI的發(fā)病機制很復(fù)雜，迄今為止尚未完全闡明。多數(shù)學者認為機體尤其是肺部氧化/抗氧化平衡失調(diào)在ALI的發(fā)

2、病中起主要作用，因為當肺臟受到各種致病因素(如創(chuàng)傷，休克，感染等)嚴重打擊時，可導(dǎo)致肺臟局部產(chǎn)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而引起ALI。此外，也有學者報道大量被扣押在肺內(nèi)的中性粒細胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)是造成ALI炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細胞。PMN在肺部被激活后處于“呼吸爆發(fā)”狀態(tài)，耗氧量大增，并產(chǎn)生過量的氧自由基，如超氧陰離子(O2(-·))和羥自由基(OH·)等。氧自由基可能通過直接損傷肺組織細

3、胞以及使蛋白酶/蛋白酶抑制物系統(tǒng)失衡而參與ALI的發(fā)生。還有文獻報道，核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)的激活在ALI的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。NF-κB激活后誘導(dǎo)大量炎癥細胞因子(TNF-α，IL-1，ICAM-1等)的釋放，進而引起炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大作用，使病情逐漸惡化。如能有效地控制NF-κB的活化及維持肺臟氧化/抗氧化的平衡，對于ALI的治療具有重要的現(xiàn)實意義。 褪黑素(melaton

4、in，MT)最初被證實是與生殖功能有關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，此后一系列研究表明，MT對機體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生物節(jié)律等都具有明顯的調(diào)節(jié)作用，但直到20世紀90年代，Tan等首次報道MT具有抗氧化作用，是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑，能有效地清除包括OH·、O2(-·)在內(nèi)的大多數(shù)活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)。此外，很多國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)MT的抗氧化作用對多數(shù)氧化應(yīng)激占重要地位的疾病有不同程度的防治

5、作用。如Esparza等研究發(fā)現(xiàn)MT可通過提高抗氧化酶的活性及其基因表達而阻止鋁離子所引起的神經(jīng)元退行性病變；Erkanl等的研究也發(fā)現(xiàn)MT清除自由基的作用可明顯減輕骨骼肌缺血/再灌注損傷。但MT是否可減輕ALI時的氧化應(yīng)激反應(yīng)，相關(guān)的文獻報道卻很少。本課題通過氣管內(nèi)滴注脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)復(fù)制大鼠ALI動物模型，探討MT對ALI的影響及其可能機制，為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實驗依據(jù)。 方

6、法：本實驗采用氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制大鼠ALI模型，并通過腹腔給予MT，觀察不同時間點超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、還原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)及肺組織病理學的變化，研究MT對肺組織的影響。 將96只雄性SpragueDawley(SD)大鼠隨機分為4組，每組2

7、4只。①Control組：經(jīng)氣管滴注無熱源生理鹽水(NS)，每只200μl，并在滴注前后30min分別腹腔注射(ip)溶媒(1％乙醇生理鹽水)1ml/kg；②LPS組：經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ip溶媒1ml/kg；③LPS+DEX組：經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ip地塞米松(dexamethasone，DEX)2mg/kg；④LPS+MT組：

8、經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ipMT10mg/kg。各組動物分別于滴注LPS后3h、6h和12h經(jīng)頸總動脈放血處死，同時留取血液及肺部標本。血液標本經(jīng)離心后取上清液，以檢測GSH含量；肺部標本分為兩部分：一部分制備成勻漿后檢測MPO、SOD、MDA的活性和含量變化；另一部分經(jīng)石蠟包埋后觀察其形態(tài)學改變，同時采用免疫組織化學染色和圖像分析系統(tǒng)觀察肺組織中NF-κB、ICAM-1的表達和分布。

9、 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差((-x)±s)來表示，組間差異用單因素方差分析(onewayANOVA)，有顯著差異者用SNK-q檢驗進行兩兩比較，均以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果：1血清中GSH含量的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h血清GSH含量顯著降低(P均＜0.01)，且6h時GSH含量最低，相鄰時間點之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比

10、較，LPS+MT組血清中GSH含量明顯升高(P＜0.05或＜0.01)，但個別時間點仍然低于Control組(P＜0.05)。 2肺組織中MPO活性的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中MPO活性顯著升高(P均＜0.01)，且6h時MPO活性達到高峰，相鄰時間點之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組肺組織MPO活性明顯降低(P＜

11、0.05或＜0.01)，但個別時間點仍高于Control組(P＜0.01)。 3肺組織中SOD活性的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中SOD活性顯著降低(P均＜0.01)，且6h時SOD活性降到最低，相鄰時間點之間有顯著差異(P均＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組肺組織SOD活性明顯升高(P＜0.05或＜0.01)，但仍低于Control組(P＜0.0

12、5或＜0.01)。 4肺組織中MDA含量的變化：與Control組相應(yīng)時間點比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中MDA含量顯著升高(P均＜0.01)，且6h時MDA含量達到高峰，相鄰時間點之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時間點比較，LPS+MT組肺組織MDA含量明顯降低(P＜0.05或＜0.01)，但仍高于Control組(P＜0.05或＜0.01)。 5肺組織形態(tài)學觀察：

13、Control組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無滲出液；滴注LPS后3h肺泡間隔明顯增厚，肺泡萎陷及炎細胞浸潤，6h時肺泡結(jié)構(gòu)已無法辨認，肺內(nèi)大量炎細胞浸潤，12h時炎癥改變?nèi)暂^明顯；LPS+MT組(LPS+DEX組)3h時改變同Control組，6h與12h時肺泡結(jié)構(gòu)仍然存在，肺泡間隔略增厚，PMN浸潤較LPS組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)滲出不明顯，但個別區(qū)域炎癥改變較突出。 6肺組織免疫組織化學染色觀察：①NF-κB：Cont

14、rol組肺臟NF-κB表達的陽性信號(棕黃色)僅存在于氣道黏膜上皮細胞，均為胞漿陽性，且陽性信號較弱；LPS組各時間點的陽性信號較Control組明顯增強(3h時表達最強，P＜0.01)，主要分布在氣道黏膜上皮細胞、浸潤的炎細胞和血管內(nèi)皮細胞，且很多細胞胞漿與胞核均呈陽性；LPS+MT組(LPS+DEX組)NF-κB陽性細胞分布與LPS組類似，但胞核陽性的細胞顯著減少，且陽性信號明顯減弱(3h時P＜0.01)。②ICAM-1：Contr

15、ol組肺臟ICAM-1表達的陽性信號(棕黃色)僅分布于氣道黏膜上皮細胞，為胞漿陽性，且陽性信號較弱，而血管內(nèi)皮細胞未見表達；LPS組各時間點的陽性信號較Control組明顯增強(6h時表達顯著增強，且持續(xù)到12h，6h時P＜0.01)，主要分布在血管內(nèi)皮細胞和氣道黏膜上皮細胞，均為胞漿陽性；LPS+MT組(LPS+DEX組)的陽性細胞分布與LPS組類似，但陽性信號明顯減弱(6h時P＜0.05)，尤其是血管內(nèi)皮細胞。 結(jié)論：1氣管