褪黑素對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的影響及其機(jī)制初探.pdf

1、目的：急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是臨床常見的由感染等多種因素引起的彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷，也是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)在肺部的典型表現(xiàn)。ALI的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，迄今為止尚未完全闡明。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為機(jī)體尤其是肺部氧化/抗氧化平衡失調(diào)在ALI的發(fā)

2、病中起主要作用，因?yàn)楫?dāng)肺臟受到各種致病因素(如創(chuàng)傷，休克，感染等)嚴(yán)重打擊時(shí)，可導(dǎo)致肺臟局部產(chǎn)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引起ALI。此外，也有學(xué)者報(bào)道大量被扣押在肺內(nèi)的中性粒細(xì)胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)是造成ALI炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。PMN在肺部被激活后處于“呼吸爆發(fā)”狀態(tài)，耗氧量大增，并產(chǎn)生過量的氧自由基，如超氧陰離子(O2(-·))和羥自由基(OH·)等。氧自由基可能通過直接損傷肺組織細(xì)

3、胞以及使蛋白酶/蛋白酶抑制物系統(tǒng)失衡而參與ALI的發(fā)生。還有文獻(xiàn)報(bào)道，核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)的激活在ALI的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。NF-κB激活后誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1，ICAM-1等)的釋放，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大作用，使病情逐漸惡化。如能有效地控制NF-κB的活化及維持肺臟氧化/抗氧化的平衡，對(duì)于ALI的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 褪黑素(melaton

4、in，MT)最初被證實(shí)是與生殖功能有關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，此后一系列研究表明，MT對(duì)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生物節(jié)律等都具有明顯的調(diào)節(jié)作用，但直到20世紀(jì)90年代，Tan等首次報(bào)道MT具有抗氧化作用，是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑，能有效地清除包括OH·、O2(-·)在內(nèi)的大多數(shù)活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)。此外，很多國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)MT的抗氧化作用對(duì)多數(shù)氧化應(yīng)激占重要地位的疾病有不同程度的防治

5、作用。如Esparza等研究發(fā)現(xiàn)MT可通過提高抗氧化酶的活性及其基因表達(dá)而阻止鋁離子所引起的神經(jīng)元退行性病變；Erkanl等的研究也發(fā)現(xiàn)MT清除自由基的作用可明顯減輕骨骼肌缺血/再灌注損傷。但MT是否可減輕ALI時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道卻很少。本課題通過氣管內(nèi)滴注脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)復(fù)制大鼠ALI動(dòng)物模型，探討MT對(duì)ALI的影響及其可能機(jī)制，為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方

6、法：本實(shí)驗(yàn)采用氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制大鼠ALI模型，并通過腹腔給予MT，觀察不同時(shí)間點(diǎn)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、還原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)及肺組織病理學(xué)的變化，研究MT對(duì)肺組織的影響。 將96只雄性SpragueDawley(SD)大鼠隨機(jī)分為4組，每組2

7、4只。①Control組：經(jīng)氣管滴注無熱源生理鹽水(NS)，每只200μl，并在滴注前后30min分別腹腔注射(ip)溶媒(1％乙醇生理鹽水)1ml/kg；②LPS組：經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ip溶媒1ml/kg；③LPS+DEX組：經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ip地塞米松(dexamethasone，DEX)2mg/kg；④LPS+MT組：

8、經(jīng)氣管滴注LPS(100μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分別ipMT10mg/kg。各組動(dòng)物分別于滴注LPS后3h、6h和12h經(jīng)頸總動(dòng)脈放血處死，同時(shí)留取血液及肺部標(biāo)本。血液標(biāo)本經(jīng)離心后取上清液，以檢測(cè)GSH含量；肺部標(biāo)本分為兩部分：一部分制備成勻漿后檢測(cè)MPO、SOD、MDA的活性和含量變化；另一部分經(jīng)石蠟包埋后觀察其形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色和圖像分析系統(tǒng)觀察肺組織中NF-κB、ICAM-1的表達(dá)和分布。

9、 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)來表示，組間差異用單因素方差分析(onewayANOVA)，有顯著差異者用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：1血清中GSH含量的變化：與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h血清GSH含量顯著降低(P均＜0.01)，且6h時(shí)GSH含量最低，相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比

10、較，LPS+MT組血清中GSH含量明顯升高(P＜0.05或＜0.01)，但個(gè)別時(shí)間點(diǎn)仍然低于Control組(P＜0.05)。 2肺組織中MPO活性的變化：與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中MPO活性顯著升高(P均＜0.01)，且6h時(shí)MPO活性達(dá)到高峰，相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS+MT組肺組織MPO活性明顯降低(P＜

11、0.05或＜0.01)，但個(gè)別時(shí)間點(diǎn)仍高于Control組(P＜0.01)。 3肺組織中SOD活性的變化：與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中SOD活性顯著降低(P均＜0.01)，且6h時(shí)SOD活性降到最低，相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P均＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS+MT組肺組織SOD活性明顯升高(P＜0.05或＜0.01)，但仍低于Control組(P＜0.0

12、5或＜0.01)。 4肺組織中MDA含量的變化：與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS組氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和12h肺組織中MDA含量顯著升高(P均＜0.01)，且6h時(shí)MDA含量達(dá)到高峰，相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P＜0.05或＜0.01)；與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，LPS+MT組肺組織MDA含量明顯降低(P＜0.05或＜0.01)，但仍高于Control組(P＜0.05或＜0.01)。 5肺組織形態(tài)學(xué)觀察：

13、Control組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無滲出液；滴注LPS后3h肺泡間隔明顯增厚，肺泡萎陷及炎細(xì)胞浸潤，6h時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)已無法辨認(rèn)，肺內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤，12h時(shí)炎癥改變?nèi)暂^明顯；LPS+MT組(LPS+DEX組)3h時(shí)改變同Control組，6h與12h時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)仍然存在，肺泡間隔略增厚，PMN浸潤較LPS組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)滲出不明顯，但個(gè)別區(qū)域炎癥改變較突出。 6肺組織免疫組織化學(xué)染色觀察：①NF-κB：Cont

14、rol組肺臟NF-κB表達(dá)的陽性信號(hào)(棕黃色)僅存在于氣道黏膜上皮細(xì)胞，均為胞漿陽性，且陽性信號(hào)較弱；LPS組各時(shí)間點(diǎn)的陽性信號(hào)較Control組明顯增強(qiáng)(3h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，P＜0.01)，主要分布在氣道黏膜上皮細(xì)胞、浸潤的炎細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，且很多細(xì)胞胞漿與胞核均呈陽性；LPS+MT組(LPS+DEX組)NF-κB陽性細(xì)胞分布與LPS組類似，但胞核陽性的細(xì)胞顯著減少，且陽性信號(hào)明顯減弱(3h時(shí)P＜0.01)。②ICAM-1：Contr

15、ol組肺臟ICAM-1表達(dá)的陽性信號(hào)(棕黃色)僅分布于氣道黏膜上皮細(xì)胞，為胞漿陽性，且陽性信號(hào)較弱，而血管內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá)；LPS組各時(shí)間點(diǎn)的陽性信號(hào)較Control組明顯增強(qiáng)(6h時(shí)表達(dá)顯著增強(qiáng)，且持續(xù)到12h，6h時(shí)P＜0.01)，主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞，均為胞漿陽性；LPS+MT組(LPS+DEX組)的陽性細(xì)胞分布與LPS組類似，但陽性信號(hào)明顯減弱(6h時(shí)P＜0.05)，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)論：1氣管