烏司他丁對(duì)內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是指機(jī)體遭受心源性以外的各種肺內(nèi)外因素(嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒及有害氣體吸入等)打擊后，出現(xiàn)彌漫性肺泡一毛細(xì)血管膜損傷所導(dǎo)致肺水腫和微肺不張等病理特征的臨床綜合征。ALI的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸窘迫和頑固性低氧血癥，晚期常并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多臟器功能障礙綜合

2、征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，發(fā)病急，病情兇險(xiǎn)，死亡率高居不下，是現(xiàn)代危重醫(yī)學(xué)中的難題。
　　 ALI的發(fā)病機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。目前人們普遍認(rèn)為ALI是全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflanmatory response syndrom，SIRS)在肺部的表現(xiàn)，其本質(zhì)是一種肺內(nèi)過(guò)度性、失控性炎性反應(yīng)。而ALI與一般炎癥的區(qū)別在于它在某些環(huán)節(jié)上存在抗

3、炎性反應(yīng)和炎性反應(yīng)的失衡，損傷與抗損傷的平衡機(jī)制遭到破壞，細(xì)胞因子在此過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。因此，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡及其上游的調(diào)控研究，成為All發(fā)病機(jī)制的研究重點(diǎn)，對(duì)于揭示ALI的發(fā)生發(fā)展以及以此為靶因素的治療措施的研究具有重要意義。
　　 細(xì)胞因子按其在炎性反應(yīng)中的不同作用可分為促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子。促炎性細(xì)胞因子中腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α是釋放最早、最重要的內(nèi)源性

4、介質(zhì)，在炎癥過(guò)程中具有啟動(dòng)和觸發(fā)作用。白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-10則被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的抗炎性細(xì)胞因子，可作用于炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，在全身性炎性反應(yīng)過(guò)程中起保護(hù)作用。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-aetirated proteln kinase，MAPK)是真核細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)磷酸化其他細(xì)胞蛋白，從胞漿移位至細(xì)胞核而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，啟動(dòng)相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因

5、表達(dá)。其中p38 MAPK信號(hào)通路與炎癥調(diào)控反應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)，被認(rèn)為是屬于“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK，p38MAPK在ALI肺組織早期炎癥反應(yīng)的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制中可能具有重要作用。
　　 烏司他丁(ulinastatin，UST)是近年來(lái)研制成功并廣泛應(yīng)用于臨床的一種尿胰蛋白酶抑制劑(urinary trypsin inhibitor，UTI)。近年來(lái)有資料顯示UTI可抑制炎癥介質(zhì)釋放，預(yù)防細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制白細(xì)胞過(guò)度激活，阻斷細(xì)胞

6、因子與白細(xì)胞之間的惡性循環(huán)，在膿毒血癥、DIC、多器官功能衰竭等全身性炎癥疾病中具有肺保護(hù)作用，從而在早期阻斷SIRS向MODS的發(fā)展中扮演了重要角色，但是其詳細(xì)的作用機(jī)制還不十分明確，已有的研究基本停留在UTI對(duì)促炎性細(xì)胞因子的生成及產(chǎn)生作用的抑制效應(yīng)上，對(duì)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究甚少。UTI的肺保護(hù)作用是否和p38MAPK信號(hào)途徑相關(guān)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，其機(jī)制尚有待研究。
　　 內(nèi)毒素即脂多糖(Lipopolysaccha

7、ride，LPS)是G-菌細(xì)胞壁上的主要致病成分。感染時(shí)LPS釋放入血，可激活具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的Toll樣受體4(Toll-likereceptor，TLR4)，并經(jīng)過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞，激活細(xì)胞內(nèi)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)和各種黏附分子等基因的表達(dá)。
　　 本研究建立LPS誘導(dǎo)ALI的大鼠模型，靜脈注射UTI進(jìn)行干預(yù)，一方面通過(guò)觀察肺組織病理、濕/干重比值及血清中細(xì)胞因子的變化揭示UTI對(duì)

8、大鼠肺組織的保護(hù)作用，另一方面采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織中TNF-α mRNA的水平，并分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Western blot方法觀察肺組織中磷酸化的p38 MAPK的表達(dá)，揭示UTI抑制促炎性細(xì)胞因子TNF-α產(chǎn)生的可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為UTI的臨床應(yīng)用提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.動(dòng)物模型的建立及分組：選用健康雄性6～8周齡Wistar大鼠66只(清潔級(jí)

9、)隨機(jī)分成：對(duì)照組、模型組和烏司他丁干預(yù)組，對(duì)照組按1、3、6h分為3個(gè)亞組，模型組和干預(yù)組按0.5、1、3、6h分為4個(gè)亞組，共11組，每組6只。模型組大鼠給予LPS(5mg/kg)尾靜脈注射，干預(yù)組大鼠在尾靜脈注射LPS(5mg/kg)前30min給予UTI(50000單位/kg)尾靜脈注射。對(duì)照組大鼠給予尾靜脈注射等量的生理鹽水(NS)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)前禁食12h自由飲水。
　　 2.標(biāo)本采集：各組

10、動(dòng)物在相應(yīng)的不同時(shí)點(diǎn)分別給予3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉打開(kāi)并暴露胸腔，肉眼觀察肺組織大體病理改變。經(jīng)左心室穿刺抽血，離心后留取血清置于-80℃冰箱保存。取血結(jié)束后立即留取肺部標(biāo)本，取左肺計(jì)算肺組織濕/干重比值(W/D)；取右肺上葉以10％中性甲醛固定以備HE染色和免疫組化染色。取右肺中、下葉放入液氮中凍存，-80℃保存，以備Western blot及Real-TimeRT-PCR檢查。
　　 3.常規(guī)HE染色并計(jì)算肺組織病理?yè)p傷評(píng)分

11、。
　　 4.ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-10的濃度。
　　 5.Real Time RT-PCR法檢測(cè)肺組織中TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 6.免疫組化法檢測(cè)磷酸化的p38 MAPK蛋白在肺組織中的表達(dá)。
　　 7.Western blot法檢測(cè)肺組織中磷酸化的p38 MAPK的表達(dá)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。計(jì)量資料用means±SD表

12、示，各組之間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，其后兩兩之間比較采用LsD檢驗(yàn)，p<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.一般情況：對(duì)照組大鼠呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)無(wú)明顯變化，全部存活，抓取時(shí)迅速逃避，解剖后肺外觀色澤粉紅，無(wú)明顯異常改變；模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)均出現(xiàn)豎毛、呼吸急促(>100次/分)，口唇發(fā)紺，精神萎靡，少動(dòng)少食，抓取時(shí)無(wú)力逃避，3h組和6h組各有1只大鼠死亡，瀕死前出現(xiàn)抽搐，

13、大小便失禁，深大呼吸，四肢僵硬，解剖后肉眼見(jiàn)肺組織體積增大，臟層胸膜張力較高，表面色澤暗紅，可見(jiàn)包膜下點(diǎn)狀、片狀出血，切面疏松，有黃色或淡紅色液體溢出，尤以6h組最為明顯；干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)表現(xiàn)相對(duì)較輕，所有動(dòng)物均存活，抓取時(shí)能夠逃避，解剖后肺有類(lèi)似上述改變，但范圍小，程度輕，體積增大不明顯，表面呈紅色，可見(jiàn)少量出血點(diǎn)。
　　 2.肺組織濕/干重比值(W/D)的變化：模型組大鼠肺組織的W/D在3h和6h明顯高于對(duì)照組(p<0.01)，

14、干預(yù)組大鼠的W/D在上述兩個(gè)時(shí)點(diǎn)均較模型組降低(p<0.05)。對(duì)照組及1h的模型組和干預(yù)組大鼠W/D無(wú)明顯變化。
　　 3.肺病理學(xué)檢查
　　 3.1 HE染色：光鏡下，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，無(wú)滲出物，肺泡壁無(wú)增厚，肺泡間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔均勻一致。模型組肺組織的結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)出血、炎癥細(xì)胞及液體滲出；血管周?chē)g隙增寬，大量淡粉色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；肺泡間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞、單核巨

15、噬細(xì)胞、漿細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞，部分肺間隔變薄、斷裂，有肺氣腫形成。與模型組相比，干預(yù)組大鼠肺組織的損傷程度減輕，表現(xiàn)為肺間隔輕度增寬、無(wú)明顯出血、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 3.2病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果：模型組大鼠肺組織的病理?yè)p傷評(píng)分(5.90±0.48)明顯高于對(duì)照組(1.60±0.28)，應(yīng)用UTI干預(yù)后，病理?yè)p傷評(píng)分降低(3.62±0.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p均<0.01)。
　　 4.血清中細(xì)胞因子濃度的變化

16、
　　 4.1血清TNF-α濃度的變化：模型組大鼠血清中TNF-α的濃度在各個(gè)時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組，3h為其表達(dá)高峰，6h濃度開(kāi)始下降，UTI干預(yù)后大鼠血清中TNF-α的濃度在各個(gè)時(shí)點(diǎn)均低于模型組(p均<0.01)。
　　 4.2血清IL-10濃度的變化：對(duì)照組大鼠血清中IL-10的濃度低于檢測(cè)水平，模型組大鼠注射LPS后，IL-10的濃度逐漸升高，6h最高，各時(shí)點(diǎn)間均有明顯差異，UTI干預(yù)后血清中IL-10的濃度在各個(gè)

17、時(shí)點(diǎn)均高于模型組(p均<0.01)。
　　 5.肺組織TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量：模型組肺組織中TNF-α的mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)點(diǎn)均高于對(duì)照組，以1h時(shí)最明顯，為對(duì)照組的128倍，UTI干預(yù)后，TNF-α的mRNA表達(dá)水平下降，最高時(shí)為對(duì)照組的58倍。與模型組相比，干預(yù)組TNF-α的mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)點(diǎn)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.5h、1hp<0.01，3h p<0.05)。
　　 6.肺組織磷酸化p3

18、8 MAPK蛋白的表達(dá)
　　 6.1免疫組化染色結(jié)果：對(duì)照組肺組織中p-p38MAPK呈陰性表達(dá)，模型組肺組織p-p38MAPK呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為胞核內(nèi)(或合并胞漿內(nèi))棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞主要是肺間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，UTI干預(yù)組肺組織中p-p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞較模型組明顯減少，呈低表達(dá)。
　　 6.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組中p-p38MAPK的表達(dá)很弱，注射LP

19、S后，p-p38MAPK在模型組中的表達(dá)明顯增多，并于1h達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較均有明顯差異(p(0.01)。UTI干預(yù)后p-p38MAPK在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均低于模型組(p<0.01)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.內(nèi)毒素性ALI大鼠早期血清中促炎和抗炎性細(xì)胞因子的濃度均升高，相對(duì)于促炎性細(xì)胞因子，抗炎性細(xì)胞因子的濃度低，且時(shí)間滯后，使機(jī)體在ALI早期即存在促炎一抗炎反應(yīng)的不平衡。
　　 2

20、.靜脈注射UTI干預(yù)內(nèi)毒素性ALI，可減輕大鼠肺組織的病理?yè)p傷，降低肺水腫程度，具有肺保護(hù)作用。
　　 3.UTI通過(guò)抑制促炎性細(xì)胞因子和升高抗炎性細(xì)胞因子的濃度，改善機(jī)體促炎介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的失衡狀態(tài)發(fā)揮其肺保護(hù)作用。
　　 4.p38 MAPK信號(hào)通路參與了LPS誘導(dǎo)的ALI過(guò)程。
　　 5.UTI在轉(zhuǎn)錄水平抑制了促炎性細(xì)胞因子TNF-α mRNA的產(chǎn)生。
　　 6.UTI可能是通過(guò)抑制p38 MAPK