益氣解毒法對大鼠干細胞系WB-F344作用機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   研究具有益氣解毒功效的牛黃參(牛黃、西洋參)含藥血清對大鼠肝干細胞系WB-F344的增殖、凋亡及分化過程中相關細胞因子及受體表達的影響,探討益氣解毒法對肝干細胞的作用機制,以便從分子生物學水平來闡釋益氣解毒法治療慢性肝病的作用原理,為進一步研究治則治法提供新的思路,也為臨床推廣應用提供理論與實驗依據(jù)。
   方法:
   1.含藥血清的制備:體外培育牛黃、西洋參配伍組采用傳統(tǒng)水煎法灌胃動物制作含藥血

2、清(簡稱水煎組);依據(jù)現(xiàn)代藥理藥效研究,提取西洋參中具有抗疲勞作用的西洋參皂甙,總皂甙類成分,提取體外培育牛黃中具有保護肝細胞、恢復肝功能、利膽退黃作用的膽紅素、膽酸、去氧膽酸、?;撬犷惓煞种瞥膳|S參膠囊,后膠囊取粉稀釋使用灌胃動物制作含藥血清(簡稱成分組)。水煎組和成分組在實驗中互為對照組。將大鼠分為空白組、水煎組、成分組,每組各16只。各組給相應的藥物連續(xù)灌胃7天(1次/d),給藥濃度為:含牛黃生藥濃度3.6g/L,含西洋參生藥濃度

3、21.6g/L,大鼠按體重100g灌胃1mL的量給藥,空白組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)一周。末次給藥后2h進行大鼠頸動脈取血,將采集的血液在室溫中靜置4h,3000rpm,離心15min,收集血清,將收集的血清在56℃水浴30min進行滅活,而后在超凈臺內用注射濾器(0.22μm微孔濾膜)過濾除菌,分裝成小瓶于-20℃保存?zhèn)溆?需要時用培養(yǎng)液配制成所需濃度的含藥血清。
   2.WB-F344細胞的培養(yǎng):用50mL的培養(yǎng)瓶,將WB

4、-F344接種于含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100u/mL青霉素及鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,細胞濃度為2×104個/mL,置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞換液時間為2-3天,3-5天傳代,0.25%胰蛋白酶消化后1:2傳代。
   3.益氣解毒法對WB-F344增殖的影響:取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化,調密度為1×105/mL,接種于96孔細胞培養(yǎng)板,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后,分別加入濃度為

5、5%、10%、20%的成分組與水煎組藥物血清,空白對照組加入相同濃度梯度的正常大鼠血清,正常對照組則加入等量的培養(yǎng)液,正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組血清作用24h后,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定細胞的增殖狀況,選取增殖的最佳藥物血清濃度,后續(xù)實驗均以此濃度進行研究。
   4.益氣解毒法對WB-F344 HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1-R和TGF-β2R表達的影響:血清分為正常對照組(10%胎牛血清)、空白對照組(10

6、%正常大鼠血清)、成分組(10%成分劑血清)、水煎組(10%水煎劑血清),各組血清作用細胞24h后,裂解細胞,提取細胞的總蛋白,蛋白印跡法(Western-blot)測定各組WB-F344細胞的HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達情況。
   5.益氣解毒法對WB-F344 AFPmRNA、ALBmRNA表達的影響:取對數(shù)生長期細胞,調密度為5×103/mL,接種于96孔細胞培養(yǎng)板,8h后換分化培養(yǎng)體

7、系(高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF50ng/mL、EGF20ng/mL、胰島素1μg/mL、地塞米松1μmol/L),加入10%成分組和水煎組的含藥血清,并設立正常和空白血清對照孔,前者加入正常培養(yǎng)液,后者加入10%正常大鼠血清。于0,7、10、14、21d分別收集分化培養(yǎng)細胞,抽提總RNA,逆轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)檢測肝干細胞標志物甲胎蛋白(AFP)及肝細胞標志物白蛋白(ALB)的mRNA表達量,實驗過程中注意觀察

8、含藥血清刺激后細胞形態(tài)的變化。
   6.益氣解毒法對WB-F344凋亡的影響:調整細胞密度為1×106/mL,置于培養(yǎng)板,37℃、6小時靜置,待細胞貼壁后加入濃度為40ng/mL的轉化因子β,再分別加入各組血清干預,血清仍分為正常對照組(10%胎牛血清)、空白對照組(10%正常大鼠血清)、成分組(10%成分劑血清)、水煎組(10%水煎劑血清),待作用細胞24h后,Annexinv-FITc和PI染色,流式細胞儀測定并分析數(shù)據(jù)。

9、
   結果:
   1.益氣解毒法對WB-F344增殖的影響:10%、20%濃度的牛黃參含藥血清成分組和水煎組均能促進WB-F344細胞的增殖,與空白、正常對照組比較OD值顯著升高(P<0.01);且10%為細胞增殖的最佳濃度梯度;各組合藥血清均未表現(xiàn)出對細胞的毒性作用,鏡下觀察各組細胞生長良好。
   2.益氣解毒法對WB-F344 HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R表達的影響:經(jīng)10

10、%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預后,WB-F344細胞HGFR、EGF、ECFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達量較空白、正常對照組明顯升高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01);且部分指標成分組優(yōu)于水煎組(P<0.05)。
   3.益氣解毒法對WB-F344 AFPmRNA、ALBmRNA表達的影響:經(jīng)10%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預后,WB-F344肝干細胞表面標志物AFPmRNA的表達量在細胞分化過程中隨著時間的延

11、長逐漸減少,肝細胞表面標志物ALB mRNA的表達量則逐漸增多(P<0.01);且成分組優(yōu)于水煎組(P<0.05)。
   4.益氣解毒法對WB-F344凋亡的影響:經(jīng)10%牛黃參含藥血清成分組和水煎組干預后,WB-F344細胞的凋亡率與空白、正常對照組相比顯著下降(P<0.01),且成分組優(yōu)于水煎組(P<0.05)。
   結論:
   1.益氣解毒法可以促進肝干細胞WB-F344的增殖,對細胞未表現(xiàn)出明,顯的

12、毒性作用。
   2.益氣解毒法可以促進肝干細胞WB-F344細胞因子HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R和TGF-β2R的表達量上調。
   3.益氣解毒法可以通過細胞因子體系誘導肝干細胞WB-F344向肝細胞特異性方向的分化。
   4.益氣解毒法具有拮抗肝干細胞WB-F344凋亡的作用。
   5.益氣解毒法所選中藥復方隨劑型的不同,療效亦有一定的差異,本實驗中成分劑牛黃參膠囊較牛黃參水煎劑效

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