肝癌細(xì)胞系中氧化還原能力調(diào)控與腫瘤干細(xì)胞特性間的相互作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本文目的是研究肝臟腫瘤細(xì)胞調(diào)控氧化應(yīng)激的機(jī)制及腫瘤干細(xì)胞在抗氧化應(yīng)激過程中的作用，探尋參與調(diào)節(jié)腫瘤干性特征與抗氧化應(yīng)激過程的相交叉的分子靶點，并人為干預(yù)后，進(jìn)一步對比肝臟腫瘤細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力及干性特征的變化。從而從腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力的生物學(xué)特性角度為腫瘤的臨床治療、基礎(chǔ)研究及新藥研發(fā)提供新的策略與思路。
　　方法：
　　1.對比肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞系Huh7與SMMC-7721對外源性RO

2、S(H2O2)抵抗能力及兩組細(xì)胞系中參與ROS調(diào)控的相關(guān)分子表達(dá)差異，探究肝癌細(xì)胞對ROS抵抗的初步機(jī)制;2.進(jìn)一步分離Huh7細(xì)胞中抗ROS的亞群，并與普通Huh7細(xì)胞比較抗ROS能力及調(diào)控ROS代謝的相關(guān)分子表達(dá)的差異，篩選出調(diào)節(jié)通路中的關(guān)鍵分子(β-catenin);3.使用β-catenin阻滯劑XAV939阻斷Wnt/β-catenin信號通路，觀察Huh7細(xì)胞抗ROS能力的變化;4.通過慢病毒干擾Huh7細(xì)胞系內(nèi)ROS產(chǎn)生基

3、因Nox1，人為減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，來比較Nox1基因干擾組與GFP（綠色熒光）對照組細(xì)胞抗ROS能力、干性特征及相關(guān)分子表達(dá)的變化，進(jìn)而探究ROS調(diào)控能力與腫瘤干性特征之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)H2O2作用后，相對于SMMC-7721細(xì)胞，Huh7細(xì)胞凋亡壞死數(shù)目更少，活性更強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平更低，同時相對高表達(dá)干性分子CD133、bmi-1，DNA修復(fù)基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌細(xì)胞

4、Huh7內(nèi)存在具有較強(qiáng)抗ROS能力的亞群（Huh7-ROS），該亞群細(xì)胞相對于普通的Huh7細(xì)胞高表達(dá)bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1，并且在經(jīng)H2O2作用后，凋亡壞死數(shù)目更少，活性更強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平更低。3.相對于未用XAV939處理的Huh7細(xì)胞，經(jīng)XAV939處理的Huh7-XAV939組細(xì)胞在H2O2作用后，細(xì)胞凋亡壞死數(shù)目更多，活性更低，細(xì)胞內(nèi)ROS水平更高，而在不使用H2O2情況下即H2O2濃度為0umol/

5、ml時，Huh7細(xì)胞的凋亡和壞死及細(xì)胞活性都沒有差異。4.干擾Huh7細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生基因Nox1的實驗組細(xì)胞（Huh7-siNox1），相對于普通的對照組綠色熒光細(xì)胞(Huh7-GFP)，不但在H2O2作用后細(xì)胞活性更高，而且還有更強(qiáng)體內(nèi)致瘤能力、集落形成能力。
　　結(jié)論：
　　1.肝癌細(xì)胞擁有較強(qiáng)的抗ROS的能力有賴于腫瘤干性分子、DNA修復(fù)基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌細(xì)胞內(nèi)存在抗ROS的亞群細(xì)胞，這一亞群也同時

6、高表達(dá)腫瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修復(fù)基因以及腫瘤干細(xì)胞信號通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自我更新等干性細(xì)胞學(xué)特性，在腫瘤細(xì)胞抗ROS過程中同樣發(fā)揮作用。XAV939作為β-catenin基因的特異性阻滯劑，可以在不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死的濃度水平抑制肝臟腫瘤細(xì)胞調(diào)控ROS抵抗的能力，進(jìn)而可增加化療藥殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，其有可能成為化療“增敏劑”，進(jìn)而在化療過程中起到輔助作用。4.通過干