Rho-Rho激酶通路與轉(zhuǎn)化生長因子β1通路在2型糖尿病大鼠腎病中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，目前臨床上還沒有特別有效的措施能夠阻止DN的發(fā)生和進(jìn)展。本研究通過探討Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路與轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)信號通路在2型糖尿病大鼠腎病發(fā)病機(jī)制中的作用以及ROCK特異性抑制劑法舒地爾(fasudil)對DN的干預(yù)效應(yīng)，有可能為DN提供新的防治策略。
　　方法：通過高脂飲食結(jié)合一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30mg/kg，i

2、.p.)建立2型糖尿病大鼠模型，并設(shè)立正常對照組。10w末，行高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，測定葡萄糖輸注率(GIR)，證實(shí)糖尿病動(dòng)物模型胰島素抵抗的存在；經(jīng)腹主靜脈取血檢測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)。隨后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組(10mg/kg/day，i.p.)。每周測各組大鼠體重及鼠尾收縮壓(SABP)。24w末留24h尿，測尿白蛋白排泄率(UAER)；腹主靜脈取

3、血測FBG、FINS、TG、TC、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。稱取左側(cè)腎臟重量，計(jì)算腎臟質(zhì)量(KW)與體質(zhì)量(BW)的比值(KW/BW)。分別留取腎組織供HE染色觀察腎臟組織形態(tài)；Masson染色和羥脯氨酸(HYP)含量測定評估腎組織膠原沉積情況；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測定腎皮質(zhì)TGF-β1mRNA、結(jié)締組織生長因子(CTGF)mRNA表達(dá)水平；Western blot法測定腎皮質(zhì)磷酸化的肌

4、球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(p-MYPT1)水平，代表ROCK的活性。
　　結(jié)果：
　　1一般情況
　　對照組大鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)如常，毛色正常。而糖尿病大鼠則出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿，活動(dòng)明顯減少，毛色晦暗。
　　2胰島素抵抗指標(biāo)10w末，與對照組相比，糖尿病大鼠GIR顯著降低(5.45±0.84mg/kg/min vs11.34±0.76mg/kg/min，P<0.01)。24w末計(jì)算三組大鼠的胰島素抵抗指

5、數(shù)(HOMA-IR=FBG×FINS÷22.5)。與對照組相比，糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR顯著增高(110.86±5.27與109.17±4.88分別vs12.23±1.99，P<0.01)。而糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠HOMA-IR的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(110.86±5.27 vs109.17±4.88，P>0.05)。
　　3 BW、KW和KW/BW10w末，糖尿病大鼠BW明顯高于對照組(P<0.05)。24

6、w末，糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的BW明顯低于對照組(P<0.05)。糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的BW差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，糖尿病組大鼠的KW和KW/BW顯著增高(P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠的KW和KW/BW較糖尿病組顯著降低(P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4血生化指標(biāo)
　　10w末，糖尿病大鼠的FBG、FINS、TG與對照組相比顯著增高(P<0.0

7、1)，TC與對照組相比顯著增高(P<0.05)。24w末，糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠與對照組相比，F(xiàn)BG、FINS、TG、TC、HbA1c均顯著增高(P<0.01)。而這些指標(biāo)在糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5腎臟相關(guān)指標(biāo)與SABP24w末，與對照組相比，糖尿病組大鼠的UAER顯著增加(0.35±0.04μg/min vs0.05±0.01μg/min，P<0.01)。而法舒地爾干預(yù)組

8、大鼠的UAER較糖尿病組顯著減少(0.08±0.04μg/min vs0.35±0.04μg/min，P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠的UAER仍高于對照組(0.08±0.04μg/min vs0.05±0.01μg/min，P<0.05)。三組大鼠的血Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的BUN較對照組顯著增高(13.56±2.19mmol/L與13.36±1.81mmol/L分別vs8.01±1.11

9、mmol/L，P<0.01)，而糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.56±2.19mmol/L vs13.36±1.81mmol/L，P>0.05)。三組大鼠的SABP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　6 HE染色結(jié)果對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常；腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，胞漿豐富。與對照組相比，糖尿病組大鼠腎小球肥大，系膜區(qū)明顯擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多；腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，胞漿丟失，泡沫樣變。法舒地爾干預(yù)組上述改變

10、均較糖尿病組明顯減輕。
　　7 HYP含量測定與對照組相比，糖尿病組大鼠腎組織HYP含量顯著增加(0.50±0.05μg/mg vs0.36±0.07μg/mg，P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組與糖尿病組相比，HYP含量明顯減少(0.37±0.04μg/mg vs0.56±0.05μg/mg，P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.37±0.04μg/mg vs0.36±0.07μg/mg，P>0.05)。
　　8

11、Masson染色結(jié)果對照組大鼠腎間質(zhì)及血管周圍可以見到少量膠原纖維的分布，膠原面密度為0.076±0.005。與對照組相比，糖尿病組大鼠腎間質(zhì)及血管周圍的膠原纖維顯著增多(膠原面密度：0.148±0.007 vs0.07±0.005，P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠腎間質(zhì)及血管周圍的膠原纖維較糖尿病組大鼠顯著減少(膠原面密度：0.0794±0.007 vs0.148±0.007，P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(膠原面密度

12、：0.0794±0.007 vs0.0764±0.005，P>0.05)。
　　9免疫組化染色結(jié)果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增多(陽性面積：21.4±3.1％vs4.3±1.5％，P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)較糖尿病組大鼠顯著減少(陽性面積：5.14±2.3％vs21.4±3.1％，P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(陽性面積：5.1±2.3％vs4.3

13、4±1.5％，P>0.05)。
　　10基因表達(dá)結(jié)果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組TGF-β1mRNA、CTGFmRNA表達(dá)較糖尿病組大鼠顯著降低(P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　11蛋白表達(dá)結(jié)果與對照組相比，糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)p-MYPT1水平顯著增加(P<0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠腎皮質(zhì)p-

14、MYPT1較糖尿病組顯著減少(P<0.01)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：高血糖能夠激活腎臟Rho/ROCK信號通路，該通路參與了對TGF-β1和CTGF表達(dá)的調(diào)控，在糖尿病腎臟系膜細(xì)胞外基質(zhì)增多的形成中發(fā)揮著重要作用。Fasudil能夠有效地抑制糖尿病腎纖維化，減少尿蛋白，這可能與它抑制了腎臟上TGF-β1/CTGF信號通路有關(guān)，發(fā)揮著不依賴于血壓、血糖控制的腎臟保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示抑制ROC