纖連蛋白及其重組肝素結合域多肽對血管內皮細胞損傷的影響.pdf

1、血管內皮細胞具有非常重要的生理功能，主要體現(xiàn)在： 1.構成天然屏障，維持血管內膜光滑，防止血小板和白細胞粘附及有害物質侵入血管壁； 2.組成滲透性屏障，調節(jié)物質交換和主動轉運功能； 3.參與血栓形成和止血過程，保持動態(tài)平衡，包括組織纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)等。許多病理狀態(tài)如嚴重感染、DIC等均涉及血管內皮細胞的功能損害，繼而加劇病理性過程，形成惡性循環(huán)。因此如何恢復病理狀

2、態(tài)下失衡的血管內皮細胞的形態(tài)與功能一直是學術界研究的重點。纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)是一種廣泛存在于細胞外液、細胞表面及結締組織等處的糖蛋白。在抗感染、維持微血管完整性及通透性等方面具有重要的作用，故曾有“調理性α2表面結合蛋白”、“細胞表面蛋白”及“細胞粘附分子”之稱。已知FN主要分為細胞型和血漿型兩種，細胞型FN主要由內皮細胞及成纖維細胞合成，它對于內皮細胞之間的連接及內皮細胞附著于內皮下層的膠原纖維起重要作用，從而保

3、證了微血管完整性。因此，研究外源性FN對某些病理因素造成血管內皮細胞損傷的修復作用是很有價值的，鑒于從血漿分離FN存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題，同時還由于FN分子量大，達450KD，全分子表達又存在技術上的難題。因此利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，來代替FN可以說是一種可行的辦法。TNF-α是一種重要的炎性介質，感染等病理情況下TNF-α增加，我們以往的研究表明，F(xiàn)N及肝素結合域多肽可防治脂多糖內毒素

4、小鼠DIC的發(fā)生，其機制就涉及抑制TNF-α的表達。因此，根據(jù)前期研究基礎，本實驗的目的在于建立TNF-α損傷血管內皮細胞損傷的模型及半乳糖胺增敏的內毒素血癥小鼠模型，通過體外和體內實驗，研究FN及肝素結構域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對血管內皮細胞的影響。 本研究內容分為以下幾個部分： 1.人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定采用酶消化法培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞；用免疫組化法檢測Ⅷ因子鑒定內皮細胞。 2.FN和兩

5、種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP制備用明膠親和層析的方法從人新鮮血漿分離FN；經SDS-聚丙烯凝膠電泳和免疫印跡(Western blot)法鑒定FN純度和特異性；兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP由本研究所自行制備的酵母表達載體中表達和制備。 3.建立TNF-α損傷人臍靜脈內皮細胞模型 3.1實驗分組： (1)空白對照組：不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs；

6、(2)不同濃度TNF-α處理組：分別用5ng/ml，10 ng/ml，20 ng/mlTNF-α作用18h； (3)不同時間TNF-α處理組：用l0 ng/mlTNF-α分別作用6h，12h，，18h，24h。 3.2用ELISA法檢測各組內皮細胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量4.研究FN及兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α作用的內皮細胞的影響4.1實驗分組： (

7、1)空白對照組：不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs； (2)TNF-α作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入與多肽等體積的培養(yǎng)液6h； (3)TNF-α+FNNHBSPP作用組：l0ng/ml TNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FNNHBSPP作用6h： (4)TNF-α+FNCHBSPP作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FNCHBSPP作用

8、6h： (5)TNF-α+FN作用組：l0ng/mlTNF-α作用18h，加入濃度為600ug/ml的FN作用6h。 4.2用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察FN及其兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α損傷的內皮細胞作用下的形態(tài)和超微結構 4.3用ELISA法檢測各組內皮細胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量5.研究FN及其兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對

9、內毒素血癥小鼠肝、肺組織血管內皮細胞的影響 5.1建立半乳糖胺增敏的內毒素血癥小鼠模型應用半乳糖胺增敏內毒素脂多糖建立內毒素血癥小鼠模型，即給小鼠腹腔注射半乳糖胺(400mg/kg)和內毒素(100ug/kg)。 5.2實驗分組：正常組、內毒素血癥組、FN作用組、FNNHBSPP作用組和FNCHBSPP作用組。在注射半乳糖胺及內毒素前半小時從其尾靜脈分別注射FN、FNNHBSPP、FNCHBSPP(20mg/kg)，內毒

10、素血癥組給等體積生理鹽水。 5.3病理形態(tài)學觀察各實驗組小鼠肝、肺組織血管內皮細胞腹腔注射藥物9小時后，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的肝、肺組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做病理形態(tài)學觀察。 5.4免疫組織化學法檢測肝、肺組織血管內皮細胞纖維連接蛋白(FN)表達取得了以下結果與 結論： 1.建立了穩(wěn)定傳代的人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)體系。 2.建立了TNF-α損傷內皮細胞的模型，

11、不同濃度的TNF-α(5，10，20ng/ml)作用于HUVECsl8h，培養(yǎng)液中PAI-1、sICAM-1的濃度與空白對照組相比，各組均增加(p<0.01)，其中以10ng/ml的TNF-α作用最明顯；用同一濃度10ng/ml的TNF-α作用6，12，18，24h，與空白對照組相比，PAI-1、sICAM-1的濃度均有明顯增高(p<0.01)，在18hTNF-α作用最明顯；tPA各組無明顯差異(p>0.05) 。 3.FN及其

12、肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的內皮細胞，培養(yǎng)液上清中PAI-1及sICAM-1的濃度均比TNF-α組明顯減低(p<0.01)，F(xiàn)N及兩種多肽的作用無明顯差異(p>0.05)。 4.建立了內毒素血癥小鼠模型，予FN及多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的小鼠肝、肺組織血管內皮細胞病變明顯減輕，血管內皮細胞的FN表達比內毒素血癥小鼠增強。 5.結論：FN及其多肽FNNHBSPP、FNCHBS