尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶平衡的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 流行病學(xué)資料提示，吸煙與動(dòng)脈或靜脈血栓形成關(guān)系密切。吸煙可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，引發(fā)纖溶失衡，從而增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)為纖溶系統(tǒng)的主要成分，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，二者的動(dòng)態(tài)平衡決定著纖溶系統(tǒng)的功能。有關(guān)吸煙對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凝血-纖溶系統(tǒng)功能影響的研究多集中在凝血方面，吸煙對(duì)纖溶系統(tǒng)的影響研究較少，其作用機(jī)制尚不完全

2、清楚。蛋白激酶C(PKC)為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通道，在血管內(nèi)皮功能紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用。尼古丁作為香煙煙霧中的主要有害物質(zhì)之一，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)功能下降，但這一作用是否通過(guò)PKC信號(hào)途徑發(fā)揮作用未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：
　　 研究不同實(shí)驗(yàn)條件下尼古丁對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)t-PA及PAI-1表達(dá)的影響，選擇尼古丁作用的最佳時(shí)間和濃度。進(jìn)一步采用PKC抑制劑星型胞菌素Staurosporine(ST

3、S)作為干預(yù)藥物，觀察其對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞t-PA、PAI-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響。從體外實(shí)驗(yàn)探討尼古丁對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶活性的影響，以及PKC途徑在該變化中的作用。
　　 方法：
　　 采用HUVECs細(xì)胞株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　 (1)尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶活性影響的時(shí)間及濃度依賴性：HUVECs培養(yǎng)后接種于24孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行以下研究。①尼古丁作用的濃度依賴性：分別用0、0.1、

4、1、10及100μmol/L的尼古丁孵育細(xì)胞，12h后收集各組上清液；②尼古丁作用的時(shí)間依賴性：用100μmol/L的尼古丁與細(xì)胞分別孵育0、4、6、8、12及24h，收集各組上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(ELISA)測(cè)定各組t-PA和PAI-1的抗原濃度。
　　 (2)PKC抑制劑(STS)干預(yù)實(shí)驗(yàn)：HUVECs培養(yǎng)后接種于25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為對(duì)照組、尼古丁組、STS組及尼古丁+STS組。對(duì)照組培

5、養(yǎng)液中不加任何干預(yù)；尼古丁組于培養(yǎng)液中加入終濃度為100μmol/L的尼古丁；STS組于培養(yǎng)液中加入終濃度為100nmol/L的STS；尼古丁+STS組于培養(yǎng)液中加入100nmol/LSTS預(yù)處理細(xì)胞30min，再加入100μmol/L的尼古丁共同培養(yǎng)。同步培養(yǎng)12h后收集各組的細(xì)胞及上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(ELISA)測(cè)定HUVECs培養(yǎng)液中t-PA和PAI-1的抗原濃度，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)各

6、組細(xì)胞t-PA和PAI-1mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)尼古丁對(duì)HUVECs纖溶平衡的影響：HUVECs與不同濃度尼古丁孵育12h后，100μmol/L尼古丁組PAI-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；0.1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L尼古丁組PAI-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)；各濃度尼古丁組t-PA蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差

7、異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。HUVECs與100μmol/L的尼古丁分別孵育0、4、6、8、12及24h后，各尼古丁組PAI-1蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且其升高呈時(shí)間依賴性；各尼古丁組t-PA蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 (2)STS在尼古丁介導(dǎo)HUVECs纖溶失衡中的作用：①尼古丁組PAI-1mRNA及蛋白含量顯著升高[1.321±0.198，

8、(21.084±0.829)ng/ml]，與對(duì)照組[0.729±0.100，(13.388±0.927)ng/ml]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)；②尼古丁+STS組PAI-1mRNA及蛋白含量[1.074±0.099，(16.190±2.149)ng/ml]較尼古丁組降低，但仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)；③尼古丁組t-PAmRNA的表達(dá)明顯下降(0.193±0.073)，與對(duì)照組(0.7820.152

9、)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；t-PA蛋白[(0.387±0.089)ng/ml)表達(dá)較對(duì)照組((0.461±0.090)ng/ml]有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；④尼古丁+STS組t-PAmRNA(0.394±0.076)的表達(dá)較尼古丁組升高，但仍低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)；t-PA蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)尼古丁可上調(diào)HUVECs