尿毒癥血清蛋白對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用.pdf

1、背景:
　　最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，成年慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)的患病率已超過了10％，由CKD導(dǎo)致的終末期腎衰也在逐年增長。隨著腎功能逐漸減退，患者會出現(xiàn)各種并發(fā)癥。流行病學(xué)結(jié)果示，即使在腎功能輕度損傷的患者，心、腦血管疾病的發(fā)病率就較同年齡、同性別的非腎臟病人群顯著增高，心、腦血管事件是尿毒癥患者最常見的并發(fā)癥和致死原因。研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥毒素是促使CKD患者心、腦血管疾病高患病率的獨立危險因

2、素。尿毒癥毒素分為蛋白結(jié)合尿毒癥毒素和游離毒素，游離毒素能被透析清除，而蛋白結(jié)合毒素卻不能通過常規(guī)透析清除，隨著時間的推移，蛋白結(jié)合毒素會在體內(nèi)蓄積，引起組織細胞損傷。由于血液內(nèi)的蛋白結(jié)合毒素與血管內(nèi)皮細胞接觸的機會多，故極有可能引起內(nèi)皮細胞損傷。
　　內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能正常是避免各種血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ);內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)受損、功能不全是血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。國內(nèi)外大量研究證實，游離的硫酸對甲酚、硫酸吲哚酚等毒素能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)等

3、機制導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷，進而促使血管疾病的發(fā)生。然而蛋白結(jié)合的尿毒癥毒素是否也能導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷，目前尚無這方面文獻報道。
　　目的:
　　本研究觀察體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)被尿毒癥患者血清蛋白刺激后的增殖能力、一氧化氮分泌量、一氧化氮合酶活性、內(nèi)皮源性膜微粒脫落率以及凋亡等指標(biāo);探討蛋白結(jié)合尿毒癥毒素(protein-bound u

4、remic toxins，PBUTs)對人血管內(nèi)皮細胞的損傷作用。
　　方法:
　　選取第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科透析室維持性血液透析的尿毒癥患者20例（男女各10例）和第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院健康管理科健康志愿者20例（男女各10例），每例各抽取靜脈全血10ml，經(jīng)過血清分離、透析、低溫真空凍干等處理后提取血清蛋白[12]，用細胞培養(yǎng)基將血清蛋白配制成0.4％、1.0％、2.0％、4.0％四種濃度，以尿毒癥血清蛋白溶液(0.4

5、％、1.0％、2.0％、4.0％)、正常血清蛋白溶液(0.4％、1.0％、2.0％、4.0％)刺激HUVEC細胞，設(shè)置空白對照組，刺激24h、48h、72h共3個實驗時間點，檢測以下指標(biāo):
　　1) CCK-8法測定尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞的增殖能力的影響;
　　2)倒置相差顯微鏡觀察尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞的形態(tài)的影響;
　　3)一氧化氮試劑盒（硝酸還原酶法）測定尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞分泌一氧化氮

6、量的影響;
　　4)一氧化氮合成酶檢測試劑盒（熒光法）測定尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞一氧化氮合酶活性的影響;
　　5)用CD144抗體經(jīng)流式細胞儀檢測尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞的內(nèi)皮源性膜微粒脫落率的影響;
　　6)用AnnexinV/PI雙染細胞凋亡試劑盒經(jīng)流式細胞儀和DAPI染核法檢測尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞增殖能力的影響

7、r>　　在相同實驗時間點（24h、48h或者72h），尿毒癥組HUVEC細胞OD值，均比空白對照組以及相同濃度的正常組明顯降低(P＜0.05);在相同實驗時間點(24h、48h或者72h)，隨著血清蛋白溶液濃度的增加，與相同濃度的正常組相比，尿毒癥組HUVEC細胞OD值均明顯減低，呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05);對于相同濃度的血清蛋白溶液，隨實驗時間的延長，與正常組相比，尿毒癥組HUVEC細胞OD值均明顯減低，呈現(xiàn)時間依賴性(P＜0.0

8、5)。
　　2.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞形態(tài)的影響
　　空白組HUVEC細胞，細胞大小均一、邊界清晰，呈短梭形、單層鵝卵石樣鋪列;正常組的HUVEC細胞，細胞大小稍不均一，細胞膜表面欠光滑，細胞觸角、突起增多;可觀察到細胞分泌的胞漿顆粒增多;尿毒癥組的HUVEC細胞，細胞生長狀態(tài)差，大小明顯不均一，細胞間隙明顯增寬，細胞膜表面粗糙，細胞觸角、突起明顯增多，部分觸角、突起交織呈網(wǎng)狀，觀察到細胞分泌的胞漿顆粒明顯增多。

9、r>　　3.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞一氧化氮分泌的影響
　　干預(yù)72h后，空白組HUVEC細胞NO的分泌量約為（13.24±0.32）umol/L，0.4％、1.0％、2.0％、4.0％正常組HUVEC細胞NO的分泌量約為（12.68±0.55）umol/L、(10.10±0.30) umol/L、(7.86±0.49) umol/L、(7.40±0.14) umol/L;0.4％、1.0％、2.0％、4.0％尿毒癥組HUV

10、EC細胞NO的分泌量約為(9.46±0.29)umol/L、(6.64±0.28)umol/L、（5.42±0.50）umol/L、（3.92±0.34）umol/L;隨著血清蛋白溶液濃度呈梯度增加，尿毒癥組HUVEC細胞的NO分泌量逐漸減少，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)。
　　4.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞一氧化氮合酶活性的影響
　　干預(yù)72h后，空白組HUVEC細胞NOS合酶活性O(shè)D值約為（192.39±3.69

11、），0.4％、1.0％、2.0％、4.0％正常組HUVEC細胞NOS合酶活性O(shè)D值約為（184.39±4.58）、（169.33±7.33）、（151.83±3.95）、（148.68±3.20）;0.4％、1.0％、2.0％、4.0％尿毒癥組HUVEC細胞NOS合酶活性O(shè)D值約為（142.91±4.50）、（128.67±5.10）、（113.98±3.17）、（59.42±3.74）;尿毒癥組OD值明顯下降，與空白組、正常組差異具有

12、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);隨著血清蛋白溶液的濃度呈梯度增加，尿毒癥組HUVEC細胞的NOS合酶活性O(shè)D值明顯降低;且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)。
　　5.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞內(nèi)皮源性膜微粒脫落率的影響
　　干預(yù)72h后，空白組、4.0％正常組、4.0％尿毒癥組EMPs的脫落率分別為（7.30±0.57）％、（13.0±0.94）％、（62.57±1.59）％，與空白對照組、正常組相比，尿毒癥組EMPs脫落率明

13、顯升高(P＜0.05)。
　　6.尿毒癥血清蛋白對HUVEC細胞凋亡的影響
　　干預(yù)72h后，空白組、4.0％正常組和4.0％尿毒癥組細胞凋亡率分別為（4.44±1.74）％、（5.49±1.57）％、（6.2±1.17）％，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　尿毒癥血清蛋白能抑制HUVEC細胞增殖、抑制其分泌NO、促進其EMPs脫落，導(dǎo)致HUVEC細胞損傷，提示蛋白結(jié)合尿毒癥毒素是心腦血管并發(fā)癥的重要